Способ получения зеаксантина - SU575037A3

Изобретение касается шособа псшучения якатого пигмента, именуемого зеаксавтином или 3,3 дигидрокси - Jj - каротина, путем культявировання микроорганизма, производящего это вещество.

Такой пигмент может быть использован, например , в качестве добавки в корм для кур с целью интенсифицирования желтой окраски их кожи дпя интенсифицирования окраски желтков ящ. Кроме того, зеаксантин можно применять в каэдстге красителя , например, в косметической промытленности .

Синтез пигмейтоа некоторыми микроорганизмами и, в частности синт езкаротиноидных пигментов бaктepня ш вида Flavobacter известен. Однако промышленное производство зтих пигментов путем биосинтеза представляется обычно тонким делом и достигаемые выходы малы и для получения существенных количеств пигмента приходится прибегать к очень большому количеству срер, для культивирования.

Изобретение относится к получению зеаксантина путем биосинтеза простым способом с повышением выхода пигмента. Изобретение касается способа получения зеаксантина путем культивирования производящего этот пигмент микроорганизма вида Flavobacter, при котсфом микроорганизм культивируют в питательной среда до получения клеток на стадии роста производств зеаксантина , после чего эти клетки культивируют орт температуре 22- 25° С в условиях достаточного насьпцешгя кислородом в ферментационной питательной q)eдe, содержащей не менее 25-35 мг/мл угг лерода, являющегося источником усвояемого углерода , источник ассимилируемого аминированно го азота, содержащего свободные аминированкыв кислоты; содержание зтих веществ поддерживают примерно в постоянном отношении, постепенно вводя их в процессе культивирования в ферме тадионную среду, причем культивирование продолжают до накопления в среде достаточного-количества зеаксашина.

Микроорганизм вида Ftavobacter представляет собой микроорганизм, избранный среди бакретиА зтогр вида, или мутант подобного микроорганизма. Выражение в условиях достаточного насыщения кислородом означает, что содержание кислорода в культивируемой среде никогда не опускается ниже порогового значетш, ниже которого оно становится фактором, ограш1чивающим степень роста микроорганизмов в условиях культивирования.

Условия достаточного насыщения кислородом могут быть| например, обеспечены нродуванием возгуха и энергичным размешиванием культивируемой среды. Питателыая означает среду культивирования, содержащую вещества, необходимыв для жизнедеятельности микроорганизма ими всшмилируемые; Среди таких веществ можно назвать источники углерода, азота и минеральные соли. Однако питательная среда может содержать и иные веп ества - витамины, факторы роста и микроэлементы .

Согласно изобретению гЛовят культуру микроорганизма вида Fiavobacter, которую потом инокулируют в питательную среду, помепданную в ферментер и со держанную в качестве источника усвояемых микрооргашзмамй углерода и азота. Рост микроорганизмов в ферментере поддерживают путем достаточного насыщения среды кульйширования кислородом и поддержаю1ем надЛежащей температуры - порядка 18 и 30° С и соответ ствующего рН.

Когда культура вступИт в фазу экспоненциального роста и клетки достигнут С1.4ШН производства зеаксантина (легко обшруживающую, бтагодаря желтой окраске этого пигмента), культивирование клеток продолжают в условиях достаточнш-о насыщения , кислородом при те&отературе от 22 до 25° С в водной питательной среде, содержащей от 15 до 35 мг/мл хотя бы одного .углевода н источник усвояемого аминировагшого азота, содерхшщего свободные аминокислоты, причем неизменное соотнощение соответствуювдйх количеств обеспечивается последовательной добавкой обоих веществ в питательную феду.

Углевод, который является основным источНИКОМ усвояемого микроорганизмом углерода, может избираться среди таких веществ как глюкоза , лактоза и сахароза. Основным источником усвояемого углерода может также быть смесь этах веществ.

Среди веществ, приемлемых в качестве компонентов основного источника аминного азота, можно указать, например, настой от вымачивания кукурузы, зкстракт дрожжей, гидролизаты протеина , в частности продукты, полученные при кислотном или ферментативном гидролизе протеинов растительного происхождения, например протеины сои или арахиса и/ю1И гидролизат казеина (трилтон). Этот источник аминного азота может также содержать вещество, приготовленное путем кислотного или ф- рментативного гидролиза биомассы , вьщеленной в качестве побочного продукта биосинтеза каротиноидного пигмента при культивиpOBai-ти бактерии вида Fiavobacter, в частности путем гидролиза биомассы Fiavobacter, культивирсванной с целью получения зеаксантина, из кото . рой пигме1п уже выделен.

Затем культивирован} ; продолжают в этих условиях в течение време}ш, достаточного для получения в культивируемой среде значительного

количества зеаксантина, содержащегося в клетках пигмента. К концу зтого периода можно прекратить добавление источников углерода и азота, дав композиции культивируемой среды развиваться по мере потребления микроорганизмами ннтатепьных вешрств.

Во время ферментации рН культивируемой среды регулируется в пределах 6,5-8,0, предпочтительно между 7,0 и 7,5. Регулирование рН может бьггь обеспечено с помощью щелочных растворов, например водных растворов едкого натра, едкого

кали или гидроокиси аммония или с помощью струи аммиака, предоочтительны два последних вещества, поскольку они одновременйо - источники ассимилируемого микроорганизмами аминного азота.

Затем зто культивирование продолжают в течение времени, достаточном для образования -в среде значительного количества зеаксяита. Купьтивировалие можно продолжать и после прекращения добавзюния питательных веществ.

Иослючительно интересные результаты получены при описанном выще культивировании в случае воздействия 1 - метил - 1 - нитро - 1 - нитрозогуандина (МННГ) на некоторые бактерии вида Fiavobacter по способу мутации, заключающемуся в том, что воздействие МННГ на бактерии проводят в отвержденной среде.

Согласно специальной форме осуществления зтого способа мутации готовят культуру бактерии вида Fiavobacter, производящей зеаксантин.

Эту культуру разбавляют в стерильном физиологическом растворю и полученный раствор потом смещивают в надлежащем отнощении в чаппсе Петри с водным раствором МННГ, например с эквивалентным объемом водного раствора МННГ, содержаищм 1-10 мг этого вещества на 1 мль Затем в полученный раствор выливают расплавленньШ агар, который тщательно смешивают с раствором. После затвердевания агара полученную твердую среду поддерживают при температуре инкубации 25-28° С до появления в среде колоний. Колонии затем забирают и несколько раз подряд пересаживают на твердые питательные подложки.

МутантНый микроорганизм может стать объектом одной или нескольких исследующих операций мутации в затвердевшей среде.

Результаты экспериментов показали, что мутация , осуществленная в затвердевщей С)реде с помощью мутагенного агента позволяет получить из бактерий вида Fiavobacter мутанты, произво)11дацие в идентичных условиях культивирования зеаксантин в количестве, шмного превосходящем результаты действия мутантов, полученных при обычных способах мутации из тех же бактерий и с помошью того же мутагенного агента.

Результаты экспериментов показали, что при культивировании мокроорганизма предлагаемым способом производство зеаксантина намного превышает выход его из культуры того же микроорганизма , но при обычно практикуемых условиях. После концентрирования бульона культуры экстрагируют из клеток зеаксантин с помощью полярного органического растворителя, например адатона, этилового спирта или хлорирсдааниого растворителя, например хлороформа.

Сепарирование биомассы из культуры можно осуществить, например, центрифугированием, декантацией или фильтрованием. Биомасса может использоваться в качестве добавки к корму для кур, или может быть подвержена экстрагированию с помощью полярного органического растворителя. Пример 1. Готовят начальную культуру вида Flavobacter (АТСС № 21588), которую пересаживают в количестве 5 об.% в находящуюся в ферментере водную питательную среду. Питательная среда, предварительно простерилизованная в течение 40 мин. при 120° С и потом охлажденная до 28 С, рН регулируемьпй с помощью аммиака в даапазЬне 6,9-7,1 имела следующий состав,%: Глюкоза (отдельно стерилизованная в концентрированном растворе)7,0

Настой от вь1мачива1шя кукурузы 1,6 Гидролиэат казеина (триптон) 0,8 Экстракт дрожжей1,8

Сернокислый магний0,5

Кукурузное масло0,08

Вода вод(Я1роводнаяДо 100

Микроорганизм культивируется в ферментере 1ФИ 28° С продуванием воздуха при энергичном размеишвании с непрерьшным регулированием рН в диапазоне 7,2-7,3 путем систематитеского добавления разбавленного водного раствора аммиака.

Осуществленная в таких условиях культура обладает 6-7-часовой латентной фазой, производство зеаксантина начинается через 14 час культивирования .

Когда содержание глюкозы в ферметационной среде достигнет, уменьшаясь 25 кг/мл; т.е. через 24 час после начала культивирования, температуру среды доводят до 24° Сив ферментер постепенно вводят питательный субстрат, пред аоительно простереяизованньш в отдельном сосуде так, чтобы содержание глюкозы было постоянным. Состав питательного субстрата,%:

Глюкоза32

Настой от намачивания кукурузы4,7

Гидро.изаг казеина (тоиптон)4,3

Экстракт дрожжей5,5

Вода водопроводнаяДо 100

рН7,7

Постепенную добавку состава продолжают в течение 20 Ч1:, причем температура поддерживается 244.

После суммарного культивирования в течение 50 час измеряют содержавшем зеаксантина в культуральной среде. Для этого биомассу отделяют от питательг го субстрата путем центриф.-ировання и

зеакгангин экстрапфуют из клеток ацетоном. Раствор зеаксантина в ацетоне определяют путем колорометрического сопоставления с титрованными растворами синтетического зеаксантина в том же растворителе.

Изькренное таким образом содержание зеаксантина в ферментационной среде составило 20 мкг/мл.

Дд1. сравнения, также начальная культура выращквалась обш пр1шятым способом. С этой целью ею инокулировали 5.об.% в таком же количестве предварительно простерилизованной jf охлажденной до 28° С питательно.; среды рН, регулировавшемся в пределах 6,9-7,1. Композиция имела следующий

состав,%:

Глюкоза10,0

Настой от вымачивани; кукурузы1,85

Гидролизат казеина (трштточ)1,25

Экстракт дрожжей2,1

Еернокисльй магшй0,5

Кукурузное масло0,08

Вода водопроводнаяДо 1000

Культипвирование проводилось с размешнваfffleM при энергичном продувании воздуха с непрерьшным регулированием рН до уровня 7,2-7,3. Д1штельность латентной фазы 8 час. Получение зеаксантина начиналось через 15 час. Температура среды поддерживалась спустя 24 час с начала кул

тивирования на уровне 24° С. Через 55 час после начала культивирования содержание зеаксантина в ферментационной среде (определенное вышеуказанным образам) равнялась 12 мкг/мл.

Пример2, Культуру вида Flavobacter (АТСС

fP 21081) готовят в водной питательной среде (с рН поддерживавшемся на уровне 6,5), имевшей следующий состав,%: Глюкоза3,0

Экстракт дрожжей1,0

Гидролизат казеина (триптон)1,0

Сернокислый магний0,5

Г ада водолроводнаяДо 100

Культуру, содержащую 5 г клеток -микроорганизмов на 1 л питательной среды, разбавляют в

отношении 1:10 (по объему), путем ряда последовательных операций, в физиологическог. стерильном растворе, содержащем 0,9 вес.% хлористого натрия. Затем тщательно смешивают 1 мл этого

раствора с 1 мл водного раствора МННГ, содержащего 5 мг/мл этого вещества в чашке Петри. Потом 1Ш приготовленный таким образом iраствор- выливают 10мл агара и производяттщательное смешивание агара с раствором. После затвердения

агара чв жу Петри инкуСируют при температуре порядка 25-28° С до появления в отвержденной среде колоний, т.е. через двое-четверо суток. Затем колонии отбирают из ташки Петри и помещают (путем ряда последовательных операщш) на питательные агаровые подложки в отсутствии МННГ.: Полученный мутант потом инокулируют в количестве 5 о6.% в 100 мл стерильной питательной Cf9ffti рН, поддерживаемым на уровне 6,5, имеющей следующий состав,%: Глюкоза3,0 Экстракт дрожжей1,0 ГЬдролизат казеинд (триптон)1,0 Оернокиспый магний1,0 Вода водсяроводнаяДо 100 Микроорганизм культивируют в этой среде при 28° С в аэробдасс условиях в Tewime 24 час, потом эта куяьтура вновь переносится в 2л нитательноа срека такого хвз состава. Спустя 24 час фврменавауан осущесталенвюй в тех же условиях, кубатуре веревюсятся 5об.% в иаходящун)ся в ферментере питатедизую среду. Шггательиая среда, предварительно простершгазованная в течение 40 мин П{Ж и охлажданвая до 20° С рН регулируемым аьолиаком на уровне 6,9-7,1, имеет следукшос соспш,%: Глюкоза (предварительно простерилизованная в концентрированном растворе)7,0 Настой от вымашваЁшг кукурузы1,0 Гидролнзат калена (трш1тон)0,8 %сстракт дрожяеей1,8 Сернокислый ,S Кукурузное масло0,08 Вопа водопроводнаяДо 100 Культивирование произвохугт в фе нлентере при 28° С с аэ1 фова1тем, энергичным размешиванием и автокетшюским регу1ВфоваШ1ем рН среды на уровне 7,2-7,3. Длительность татентнш фазы 5-6 час, о6разова гше зваксантина ш%нается через 12 час после начала культивирования. Когда содержание глкжозы в этсж культуре достигнет, уменьшаясь, 25 кг/мл, т.е. через 22 час после качала кулынвировання температуру среды доводят до 24° С, и в нее с таким расчетом, чтобы сохранить примерно постоянный уровень содержания глюкозы, вводят, предаарительно простерилизованный питательный субстрат, рН которого регулируется на уровне 7,2, имеющий следующий состав ,%: Глнжоза32 Настой от намачивания кукурузы4,7 Гидролизат казеина (триптон)4,3 Экстракт дрожжей4,5 Вода водопроводнаяДо 100 Состав вводят постепенно в течение 20 час, причем температуру среды поддерживают на уровне 24° С. После суммарного культивирования в течение 48 час концентрация глюкозы в среде достегает 6 мг/мл, а содержание зеаксантина, измеренное . описанным в примере 1 способом, составляет 335 мкг/MJi. Пример 3. Описанным в примере 2 образом готовят мутант Flavobacter (АТСС 21081). Мутант инокулируют в 4 об.% в водную, предарительно простерилизованную в течение 40 мин ри 120° С, питательную среду и охлажденную до 28° С и помещают в ферментер. Эта питательная среда с рН регутшруемым с помощью аммиака, в пределах 6,9-7,1 имеет следующий состав,%: Глкнсоза7,8 Настой от вымачивания кукурузы1,8 Гидролизат жмыха0,7 Экстракт дрожжей2,0 Сершжнсльш магний0,5 Кукурузное масло0,08 Вода вощягроводваяДо 1QO Мжрооргавазм культдав1вдтот в фермен1ат рв 1ФИ 2:8° С, как описано в примере 2. После того, как содерхонве глюкозы в яреде достигнет 25 мг/мл, температуру среды дсшодят рю 24 Сив нее постеоенноУ что обеспешть примеряо оостоянный уровень содержания глюкозы, вводят вредаа1ште1аво просте нигазованный питательш )1й субстрат, с рН регулируемым на уровш 7,2% оюдукяцего состава,%: Dmaco3a12 от вымачивания кукурузы4,7 Гащюлизат жмыха арахиса3,5 страк дрожжей6,0 Вода водрар(юодааяДо 100 осуществлять в течевЕие 20 час при температуре 24° С. Спустя 51 час общего кульгавирования, содержание гакисозы в среде доходит до 7,5 мг/мл. Содержаиш зеаксантшга, определенное по описанному в примере 1 , равняется 312 мкг/мл. Пример 4. Приготовленную культуру бактерии Flavobacterium aguatile (АТСС № 11974) инокулируют в находящуюся в ферментере питательную среду. Это предварительно простерилизованная в течение 40 мин при температуре 120С5 охлажденная до 28° С водная питательная среда, { которой поддерживается аммиаком на уровне 6,9-7,1, идентичная питательной среде, описанной в примере 1. Культивируемый в ферментере в тех же условиях температуры рН и продувания воздуха, как в примере 1, микроорганизм обладает 6-7-часовой латентной фазой и начинает производить зеаксантин через 14 час от начала культивирования. -Когда содержание глюкозыв ферментационной среде достигнет, постепенно уменьшаясь, 25 мг/мл, т.е. спустя 24 час после начала культивирования температуру устанавливают на уровне 24° С и в ферментер вводят, предварительно простерилизованный в отдельном сосуде питательный субстрат с рН, .регулируемым на уровне 7,2. Состав субстрата аналогичен составу субстрата, описанному в примере 1. Субстрат вводится в фермеитер с расчетом на сохранение постоянного уровня содержания глюкозы в среде (25 мг/мл) в течение 20 час. Температура среды поддерживается на 24° с.

Спустя 50 час суммарного культивирования содержание зеаксантина в ферментациокмой среде определяют хромагрифированием в тонком слое и ультрафиолетовой спектроскопией.

Содержание зеаксантина в ферментационной среде пря таких методах измерения 16 мкг/мл.

Для сравнения бактерия культивировалась обычным образом (списанным, также для сравнения в примере 1). Через 55 час от начала культивирования содержание зеаксантина в ферментационной среде оказалось равным только 4 кжг/мл.

П р и м е р 5. Приготовлен по сшисашюму в примере 2 способу и при тех же самых условиях Flavobacteriufn aguatUe (ATCCN 11947).

Мутант культивировался затем в тех же питательных средах, с постепенным дoбaвлeJffieм того же питательного субстрата, как в примере 2, щжчем в тех же условиях.

Отустя 48 час суьвушрного культивирования концентрация глюкозы достагла 5 мкг/мл, а содержание зеаксантина в среде, измеренное аналогично описанному в примере 4, ргя«а 40 мг/мл.

Формула изобретения

1. Способ получения жаксанпша вутем культивирования микроорганизма рода Flavobacter как продуцента этого пигмента, отличающийся тем, что, с целью получения пигмента в «шстом виде, этот микроорганизм культивируют на питательной среще до стадии роста клеток и образования зеаксантина , после чего клетки этой культуры выдерживают при температуре 22-25° С в аэробныХ условиях в жидкой питательной среде, содержащей не менее 25-35 мг/мл углевода источника усвояемого углерода и по меньшей мере один источник усвояемого аминного азота, содержйирш свободны аминокислоты, притом соответствующие количества этих веществ поддерживают в постоянном соотношешш путем постененного добавления этих веществ в культуральную среду, и продолжают культивирование до образования в среде достаточного количества межклеточного зеаксантина.

2.Оюсоб иоп. 1,отлича ю.щ и и с я Тем, что культивиро шрше продуцента ведут в среде

рН 6,5-8,0.

3.Способ по п. 1,отличающийся тем, что в качестве углевода берут глюкозу, лактозу или сахарозу.

4.Сйособ поп. 1,от.1ич1ющийся тем,что источник аминного азота содержит экстракт

кукурузы.

5.Оюсоб по п. 1,отличающийся тем, что углевод и источник алашногс азота добавляют в культуральную cpeisy в весовом соотношении

1,6:3,4 соответстеешю.

6.Способ по п. 1,отличающийся тем, что клетки с зеаксантином выделяют из культуральной среды путем сепарирования.

7. Способ по п. 1-6, отличающийся тем,

что зеаксактин выделяют из клеток путем эксграгироваш«я полярным растворителем.