Способ репликации или амплификации кольцевой днк - RU2019130498A
Код документа: RU2019130498A
Формула
1. Способ репликации кольцевой ДНК в бесклеточной системе, включающий следующие стадии:
(1) образования реакционной смеси кольцевой ДНК в качестве матрицы с реакционным раствором, содержащим:
первую группу ферментов, которые катализируют репликацию кольцевой ДНК;
вторую группу ферментов, которые катализируют созревание фрагмента Оказаки и синтезируют две сестринских кольцевых ДНК, состоящих из катенана; и
третью группу ферментов, которые катализируют разделение двух сестринских кольцевых ДНК; и
(2) реакции взаимодействия реакционной смеси, полученной в стадии (1), где:
кольцевая ДНК включает последовательность ориджина репликации (ориджина хромосомы (oriC)), которая может связываться с ферментом, обладающим DnaA–активностью, а также включает пару последовательностей ter, каждая из которых была встроена за пределами oriC, и/или нуклеотидную последовательность, распознаваемую ферментом для разделения ДНК–мультимеров, где:
если кольцевая ДНК имеет последовательности ter, то реакционный раствор в стадии (1) также включает белок, обладающий активностью ингибирования репликации посредством связывания с последовательностями ter, и если кольцевая ДНК имеет нуклеотидную последовательность, распознаваемую ферментом для разделения ДНК–мультимеров, то реакционный раствор в стадии (1) также содержит фермент для разделения ДНК–мультимеров.
2. Способ по п. 1, где ферментом для разделения ДНК–мультимеров является Cre или XerCD.
3. Способ по п. 1 или 2, где пара последовательностей ter, каждая из которых встроена за пределами oriC, содержит: последовательность, включающую любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NN: 1–14, которая встроена как одна последовательность ter с 5’–концевой стороны oriC; и последовательность, включающую последовательность, комплементарную любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NN: 1–14, которая встроена как другая последовательность ter с 3’–концевой стороны oriC.
4. Способ по любому из пп. 1–3, где белок, обладающий активностью ингибирования репликации посредством связывания с последовательностями ter, представляет собой белок Tus или белок RTP.
5. Способ по п. 2, где нуклеотидная последовательность, распознаваемая XerCD, представляет собой последовательность, содержащую любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NN: 15–24, или комплементарную ей последовательность.
6. Способ по п. 2, где нуклеотидная последовательность, распознаваемая Cre, представляет собой последовательность, содержащую любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NN: 30–35, или комплементарную ей последовательность.
7. Нуклеиновая кислота, которая представляет собой линейную ДНК, имеющую длину от 273 п.о. до 2,0 т.п.о., и содержащую oriC, и пару последовательносей ter, каждая из которых встроена за пределами oriC, и/или нуклеотидную последовательность, распознаваемую ферментом для разделения ДНК–мультимеров.
8. Способ репликации кольцевой ДНК в бесклеточной системе, включающий следующие стадии:
(1) получения кольцевой ДНК, содержащей oriC, путем:
добавления транспозона и транспозазы oriC в буфер с образованием транспосомы oriC, где транспозон oriC представляет собой линейную ДНК, содержащую последовательность ориджина репликации (ориджина хромосомы (oriC)), которая может связываться с ферментом, обладающим DnaA–активностью, и внешние концевые последовательности (OE) у обоих концов; и
реакции взаимодействия транспосомы oriC с кольцевой ДНК, не содержащей oriC, в буфере для проведения реакции переноса,
(2) образования реакционной смеси кольцевой ДНК, содержащей oriC и полученной в стадии (1), с реакционным раствором, содержащим:
первую группу ферментов, которые катализируют репликацию кольцевой ДНК;
вторую группу ферментов, которые катализируют созревание фрагмента Оказаки и синтезируют две сестринских кольцевых ДНК, состоящих из катенана; и
третью группу ферментов, которые катализируют разделение двух сестринских кольцевых ДНК; и
(3) реакции взаимодействия реакционной смеси, полученной в стадии (2).
9. Способ по п. 8, где последовательность OE содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25 (5’–CTGTCTCTTATACACATCT–3’) и комплементарную ей последовательность, и где последовательность OE, содержащая последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, встроена у 5’–конца линейной ДНК в стадии (1), и где последовательность OE, содержащая последовательность, комплементарную последовательности, представленной в SEQ ID NO: 25, встроена у 3’–конца линейной ДНК.
10. Способ по п. 8 или 9, где кольцевая ДНК, содержащая oriC, также содержит пару последовательностей ter, каждая из которых встроена за пределами oriC, и/или нуклеотидную последовательность, распознаваемую ферментом для разделения ДНК–мультимеров, где:
если кольцевая ДНК имеет последовательности ter, то реакционный раствор в стадии (2) также включает белок, обладающий активностью ингибирования репликации посредством связывания с последовательностями ter, и если кольцевая ДНК имеет нуклеотидную последовательность, распознаваемую ферментом для разделения ДНК–мультимеров, то реакционный раствор в стадии (2) также содержит фермент для разделения ДНК–мультимеров.
11. Способ по любому из пп. 8–10, где транспозон oriC в стадии (1) также содержит пару последовательностей ter, каждая из которых встроена за пределами oriC, и/или нуклеотидную последовательность, распознаваемую ферментом для разделения ДНК–мультимеров, где:
если линейная ДНК имеет последовательности ter, то реакционный раствор в стадии (2) также включает белок, обладающий активностью ингибирования репликации посредством связывания с последовательностями ter, и если кольцевая ДНК имеет нуклеотидную последовательность, распознаваемую ферментом для разделения ДНК–мультимеров, то реакционный раствор в стадии (2) также содержит фермент для разделения ДНК–мультимеров.
12. Способ по любому из пп. 8–11, также включающий:
(4) удаление транспозона oriC из кольцевой ДНК, реплицированной или амплифицированной в продукте реакции в стадии (3).
13. Нуклеиновая кислота, которая представляет собой линейную ДНК, имеющую длину от 311 п.о. до 2,0 т.п.о., и содержащую oriC и пару последовательносей ter, каждая из которых встроена за пределами oriC, и/или нуклеотидную последовательность, распознаваемую ферментом для разделения ДНК–мультимеров, а также содержит внешние концевые последовательности (OE) у обоих концов.
14. Набор для репликации кольцевой ДНК, включающий комбинацию:
первой группы ферментов, которые катализируют репликацию кольцевой ДНК;
второй группы ферментов, которые катализируют созревание фрагмента Оказаки и синтезируют две сестринских кольцевых ДНК, состоящих из катенана; и
третьей группы ферментов, которые катализируют разделение двух сестринских кольцевых ДНК;
транспозона oriC, который представляет собой линейную ДНК, содержащую последовательность ориджина репликации (ориджина хромосомы (oriC)), которая может связываться с ферментом, обладающим DnaA–активностью, и внешние концевые последовательности (OE) у обоих концов; и
транспозазы.
15. Набор по п. 14, где транспозон oriC также содержит пару последовательностей ter, каждая из которых встроена за пределами oriC, и/или нуклеотидную последовательность, распознаваемую ферментом для разделения ДНК–мультимеров.
16. Набор по п. 15, также включающий:
белок, обладающий активностью ингибирования репликации посредством связывания с последовательностями ter; и/или
фермент для разделения ДНК–мультимеров.
