Модифицированный микроорганизм для улучшенного получения аланина - RU2016111682A

1. Модифицированный микроорганизм из семейства Pasteurellaceae, характеризующийся увеличенной экспрессией и/или увеличенной активностью фермента, кодируемого геном alaD, который кодирует аланиндегидрогеназу, ЕС 1.4.1.1,

причем увеличенная экспрессия и/или активность гена alaD по сравнению с его диким типом достигается

a) путем вставки экспрессионной конструкции, экспрессирующей ген alaD, в геном модифицированного микроорганизма,

b) путем увеличения числа копий гена alaD,

c) более сильным промотором по сравнению с диким типом гена alaD,

d) путем увеличения активности генов, повышающе регулирующих активность гена alaD, или путем уменьшения активности генов, понижающе регулирующих активность гена alaD.

2. Модифицированный микроорганизм по п. 1, содержащий 16S рДНК согласно SEQ ID NO: 1 или последовательность, которая демонстрирует идентичность последовательности, составляющую по меньшей мере 96% относительно SEQ ID NO: 1, и/или содержащий 23S рДНК согласно SEQ ID NO: 2 или последовательность, которая демонстрирует идентичность последовательности, составляющую по меньшей мере 96% относительно SEQ ID NO: 2.

3. Модифицированный микроорганизм по п. 1, причем модифицированный микроорганизм принадлежит роду Basfia.

4. Модифицированный микроорганизм по п. 3, причем модифицированный микроорганизм принадлежит виду Basfia succinicproducens.

5. Модифицированный микроорганизм по п. 4, причем дикий тип, из которого получен модифицированный микроорганизм, представляет собой штамм Basfia succiniciproducens, DD1, депонированный под номером DSM 18541 в DSMZ, Германия.

6. Модифицированный микроорганизм по п. 1 или 2, в котором ген alaD содержит нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из:

a) нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3;

b) нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

c) нуклеиновых кислот, которые являются по меньшей мере на 80% идентичными нуклеиновой кислоте согласно а) или b), причем идентичность представляет собой идентичность по всей длине нуклеиновых кислот согласно а) или b); и

d) нуклеиновых кислот, кодирующих аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 60% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеиновой кислотой согласно а) или b), причем идентичность представляет собой идентичность по всей длине аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеиновыми кислотами согласно а) или b).

7. Модифицированный микроорганизм по п. 1 или 2, причем микроорганизм дополнительно характеризуется

a) сниженной активностью пируватформиатлиазы,

b) сниженной активностью лактатдегидрогеназы,

c) сниженной активностью фосфоенолпируваткарбоксилазы или

d) любой их комбинацией.

8. Модифицированный микроорганизм по п. 1 или 2, причем микроорганизм содержит:

a) делецию гена ldhA или по меньшей мере его части, делецию регуляторного элемента гена ldhA или по меньшей мере его части или введение по меньшей мере одной вредной мутации в ген ldhA;

b) делецию гена pflD или по меньшей мере его части, делецию регуляторного элемента гена pflD или по меньшей мере его части или введение по меньшей мере одной вредной мутации в ген pflD;

c) делецию гена pflA или по меньшей мере его части, делецию регуляторного элемента гена pflA или по меньшей мере его части или введение по меньшей мере одной вредной мутации в ген pflA;

d) делецию гена pckA или по меньшей мере его части, делецию регуляторного элемента гена pckA или по меньшей мере его части или введение по меньшей мере одной вредной мутации в ген pckA; или

e) любую их комбинацию.

9. Модифицированный микроорганизм по п. 1 или 2, в котором ген ldhA содержит нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из:

a) нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NО:5;

b) нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;

c) нуклеиновой кислоты, которая является по меньшей мере на 80% идентичной нуклеиновой кислоте согласно а) или b), причем идентичность представляет собой идентичность по всей длине нуклеиновых кислот согласно а) или b); и

d) нуклеиновых кислот, кодирующих аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеиновой кислотой согласно а) или b), причем идентичность представляет собой идентичность по всей длине аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеиновыми кислотами согласно а) или b).

10. Модифицированный микроорганизм по п. 8,

в котором ген pflD содержит нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из:

a) нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7;

b) нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;

c) нуклеиновых кислот, которые являются по меньшей мере на 80% идентичными нуклеиновой кислоте согласно а) или b), причем идентичность представляет собой идентичность по всей длине нуклеиновых кислот согласно а) или b); и

d) нуклеиновых кислот, кодирующих аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеиновой кислотой согласно а) или b), причем

идентичность представляет собой идентичность по всей длине аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеиновыми кислотами согласно а) или b).

11. Модифицированный микроорганизм по п. 8,

в котором ген pflA содержит нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из:

a) нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9;

b) нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10;

c) нуклеиновых кислот, которые являются по меньшей мере на 80% идентичными нуклеиновой кислоте согласно а) или b), причем идентичность представляет собой идентичность по всей длине нуклеиновых кислот согласно а) или b);и

d) нуклеиновых кислот, кодирующих аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеиновой кислотой согласно а) или b), причем идентичность представляет собой идентичность по всей длине аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеиновыми кислотами согласно а) или b).

12. Модифицированный микроорганизм по п. 8, в котором ген pckA содержит:

a) нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11;

b) нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12;

c) нуклеиновую кислоту, которая является по меньшей мере на 80% идентичной нуклеиновой кислоте согласно а) или b), причем идентичность представляет собой идентичность по всей длине нуклеиновых кислот согласно а) или b); и

d) нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеиновой кислотой согласно а) или b), причем идентичность представляет собой идентичность по всей длине аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеиновыми кислотами согласно а) или b).

13. Способ получения аланина, включающий:

I) культивирование модифицированного микроорганизма по любому одному из пп. 1-12 при подходящих условиях культивирования в культуральной среде с обеспечением для модифицированного микроорганизма возможности продуцировать аланин, тем самым получая ферментативный бульон, содержащий аланин;

II) извлечение аланина из ферментативного бульона, полученного на стадии способа I).

14. Способ по п. 13, в котором культуральная среда в качестве ассимилируемого источника углерода содержит глюкозу, сахарозу, ксилозу, арабинозу и/или глицерин.

15. Способ по п. 13, в котором культивирование модифицированного микроорганизма проводят при анаэробных или микораэробных условиях.

16. Способ по любому одному из пп. 13-15, где способ дополнительно включает стадию:

превращение аланина, содержащегося в ферментативном бульоне, полученном на стадии способа I), или превращение извлеченного аланина, полученного на стадии способа II), во вторичный органический продукт, отличающийся от аланина, по меньшей мере одной химической реакцией.

17. Применение модифицированного микроорганизма по любому одному из пп. 1-12 для ферментативного получения аланина.