Способ ферментативного получения l-аминокислоты с использованием коринеформных бактерий - RU2247778C2

Описание

Настоящее изобретение относится к способу ферментативного получения L-аминокислот с использованием коринебактерий, в которых усиливают ген глютаматдегидрогеназы.

Предпосылки создания изобретения

L-аминокислоты находят применение в кормах для животных, медицине и в фармацевтической промышленности.

L-аминокислоты получают ферментативным путем с использованием продуцирующих L-аминокислоты штаммов коринебактерий, прежде всего с использованием Corynebacterium glutamicum. Поскольку эта группа продуктов имеет большое значение, постоянно ведутся работы по совершенствованию способа их получения. Усовершенствования способа могут касаться технических сторон процесса ферментации, таких как, например, перемешивание и обеспечение кислородом, или состава питательных сред, например, концентрации сахара в процессе ферментации, или обработки продукта, например, с помощью ионообменной хроматографии, или присущей микроорганизму продуктивности.

Для улучшения продуктивности микроорганизмов применяют методы мутагенеза, селекции и отбора мутантов. Таким путем получают штаммы, которые обладают устойчивостью к антиметаболитам, таким как, например, аналог лизина 8-(2-аминоэтил)цистеин, или которые являются ауксотрофами в отношении обладающих регуляторной функцией аминокислот и продуцируют L-аминокислоты.

В течение ряда лет для улучшения продуцирующих L-аминокислоты штаммов Corynebacterium glutamicum также применяют методы рекомбинантной ДНК, с помощью которых амплифицируют отдельные гены биосинтеза и исследуют влияние на продуцирование L-аминокислот. Обзор работ в этой области можно найти среди прочего у Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria" в Biology of Industrial Microorganisms, под ред. Demain и Solomon, изд-во Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142), у Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), у Jetten и Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)), и у Sahm и др. (Annuals of the New York Academy of Sciences 782, 25-39 (1996)).

Фермент глютаматдегидрогеназа катализирует восстановительное аминирование α -кетоглутаровой кислоты с образованием глутаминовой кислоты. Во французской выложенной заявке на патент 2575492 описан фрагмент ДНК из штамма Corynebacterium melassecola 801, несущий ген глютаматдегидрогеназы. В заявке рассматривается возможность его применения с целью повысить продуцирование глутаминовой кислоты при ферментации с использованием Corynebacterium melassecola. Нуклеотидная последовательность гена глютаматдегидрогеназы штамма Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 описана у Bormann и др. (Molecular Microbiology 6, 317-326 (1992)). Нуклеотидная последовательность гена глютаматдегидрогеназы Peptostreptococcus asaccharolyticus описана у Snedecor и др. (Journal of Bacteriology 173, 6162-6167 (1991)).

Задача изобретения

Задачей изобретения является разработка новых подходов по усовершенствованию способа ферментативного получения других L-аминокислот.

Описание изобретения

L-аминокислоты находят применение в кормах для животных, медицине и в фармацевтической промышленности. Поэтому большой интерес представляет разработка нового улучшенного способа получения L-аминокислот.

Если в дальнейшем упоминаются L-аминокислоты, то при этом подразумеваются такие образующие протеин аминокислоты, как L-лизин, L-треонин, L-изолейцин, L-валин, L-пролин, L-триптофан и при определенных условиях их соли, а также L-гомосерин, прежде всего L-лизин, L-треонин и L-триптофан.

Объектом изобретения является способ ферментативного получения L-аминокислот с использованием коринебактерий, прежде всего тех, которые уже продуцируют соответствующие L-аминокислоты и в которых усиливают прежде всего сверхэкспрессируют, нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент глютаматдегидрогеназу.

Предпочтительные варианты осуществления приведены в формуле изобретения.

В контексте настоящего описания понятие "усиление" обозначает повышение в микроорганизме внутриклеточной активности одного или нескольких ферментов, кодируемых соответствующей ДНК, за счет, например, увеличения количества копий гена, соответственно генов, использования более сильного промотора или гена, кодирующего соответствующий фермент с высокой активностью, и при необходимости комбинации этих мер.

Микроорганизмы, являющиеся объектом настоящего изобретения, могут продуцировать L-аминокислоты из глюкозы, сахарозы, лактозы, фруктозы, мальтозы, мелассы, крахмала, целлюлозы или из глицерина и этанола. Они могут включать представителей коринебактерий, прежде всего из рода Corynebacterium. В роде Corynebacterium следует прежде всего отметить вид

Corynebacterium glutamicum, который, как известно специалистам, обладает способностью продуцировать L-аминокислоты.

Пригодными штаммами бактерий р. Corynebacterium, прежде всего вида Corynebacterium glutamicum, являются следующие известные штаммы дикого типа:

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806,

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870,

Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539,

Brevibacterium flavum ATCC 14067,

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 и

Brevibacterium divaricatum ATCC 14020

и полученные из них мутанты, соответственно штаммы, как, например, продуцирующие L-лизин штаммы:

Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709

Brevibacterium flavum FERM-P 1708 и

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712,

или продуцирующие L-треонин штаммы:

Corynebacterium glutamicum FERM-P 5835

Brevibacterium flavum FERM-P 4164 и

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 4180,

или продуцирующие L-изолейцин штаммы:

Corynebacterium glutamicum FERM-P 756

Brevibacterium flavum FERM-P 759 и

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 4192,

или продуцирующие L-валин штаммы:

Brevibacterium flavum FERM-P 512 и

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1845,

и продуцирующие L-триптофан штаммы:

Corynebacterium glutamicum FERM-BP 478

Brevibacterium flavum FERM-BP 475 и

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 7127.

При создании изобретения было установлено, что в результате сверхэкспрессии L-глютаматдегидрогеназы повышается эффективность синтеза коринебактериями L-аминокислот, при этом под объем настоящего изобретения не подпадает L-глутаминовая кислота.

Согласно изобретению, может применяться ген глютаматдегидрогеназы из С.glutamicum, описанный Bormann и др. (Molecular Microbiology 6, 317-326 (1992)). Кроме того, пригодным является ген глютаматдегидрогеназы из других микроорганизмов, как, например, из Peptostreptococcus asaccharolyticus, описанный у Snedecor и др. (Journal of Bacteriology 173, 6162-6167 (1991)). Кроме того, могут применяться аллели указанных генов, которые получают учитывая вырожденность генетического кода или с помощью функционально нейтральных смысловых мутаций.

Для достижения сверхэкспрессии может быть увеличено количество копий соответствующего гена или могут быть вызваны мутации в промоторной и регуляторной областях, расположенных против хода транскрипции относительно структурного гена. Таким же образом действуют кассеты экспрессии, встроенные против хода транскрипции относительно структурного гена. Кроме того, в процессе ферментативного продуцирования L-аминокислот экспрессию можно дополнительно повысить с помощью индуцибельных промоторов. Экспрессия также может быть усилена за счет увеличения продолжительности жизни мРНК. Кроме того, ферментативная активность также может быть усилена путем ингибирования разложения протеинов ферментов. При этом гены или генные конструкции либо могут находиться в различном количестве копий в плазмидах, либо их интегрируют в хромосомы и амплифицируют. В альтернативном варианте сверхэкспрессия рассматриваемых генов также может быть достигнута путем изменения состава среды и условий культивирования.

Соответствующие рекомендации можно найти у Martin и др., (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), у Guerrero и др., (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya и Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), у Eikmanns и др., (Gene 102, 93-98 (1991)), в заявке ЕР-А 0472869, в патенте US 4601893, у Schwarzer и Punier (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), у Reinscheid и др., (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), у LaBarre и др., (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), в заявке WO 96/15246, у Jensen и Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), у Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) и в известных учебниках и справочниках по генетике и молекулярной биологии.

Примерами плазмид, с помощью которых можно сверхэкспрессировать глютаматдегидрогеназу, являются pEK1,9gdh-1 и pEKExpgdh, содержащиеся в штаммах ATCC13032/pEK1,9gdh-1 и DH5α /pEKExpgdh. Плазмида pEK1,9gdh-1 представляет собой бифункциональный вектор, содержащий зависящий от НАДФ ген глютаматдегидрогеназы из С. glutamicum. Плазмида pEKExpgdh представляет собой бифункциональный вектор, содержащий зависящий от НАД ген глютаматдегидрогеназы из Peptostreptococcus asaccharolyticus.

Для продуцирования соответствующей L-аминокислоты может оказаться целесообразным наряду с глютаматдегидрогеназой дополнительно сверхэкспрессировать один или несколько ферментов, участвующих в пути биосинтеза соответствующей аминокислоты. Так, например, можно

- для повышения продуктивности продуцирующих L-лизин коринебактерий дополнительно сверхэкспрессировать ген dapA, кодирующий дигидродипиколинатсинтазу (ЕР-В 0197335),

- для повышения продуктивности продуцирующих L-валин коринебактерий дополнительно сверхэкспрессировать ген, кодирующий (ацетооксикислота)-синтазу (ЕР-В 0356739),

- для повышения продуктивности продуцирующих L-триптофан коринебактерий дополнительно сверхэкспрессировать ген, кодирующий (антраниловая кислота)-фосфорибозилтрансферазу (ЕР-В 0124048),

- для повышения продуктивности продуцирующих L-гомосерин, либо L-треонин, либо L-изолейцин коринебактерий дополнительно сверхэкспрессировать ген, кодирующий гомосериндегидрогеназу (ЕР-В 0131171).

Кроме того, для продуцирования соответствующей L-аминокислоты может оказаться целесообразным наряду со сверхэкспрессией глютаматдегидрогеназы исключить нежелательные побочные реакции (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", Overproduction of Microbial Products, под ред. Krumphanzl, Sikyta, Vanek, изд-во Academic Press, London, UK, 1982).

Для продуцирования L-аминокислот созданные согласно изобретению микроорганизмы можно культивировать непрерывно или периодически с использованием периодического процесса (культивирование партий), либо периодического процесса с подпиткой, либо периодического процесса с повторяющейся подпиткой. Обзор известных способов культивирования представлен в учебнике Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (изд-во Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) или в учебнике Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (изд-во Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

Используемая культуральная среда должна быть адаптирована к требованиям конкретного штамма микроорганизма. Описания культуральных сред для различных микроорганизмов содержатся в справочнике "Manual of Methods for General Bacteriology" Американского общества бактериологии (Washington D.C., США, 1981). В качестве источника углерода могут быть использованы сахара и углеводы, например, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, меласса, крахмал и целлюлоза, масла и жиры, например, такие как соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло, жирные кислоты, например, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирты, например, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, например, такие как уксусная кислота. Эти вещества могут применяться по отдельности или в виде смеси. В качестве источника азота могут применяться органические азотсодержащие соединения, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкость, образующаяся после замачивания зерен кукурузы до разбухания, соевая мука и мочевина, или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота могут применяться по отдельности или в виде смеси. В качестве источника фосфора могут применяться кислый фосфат калия или дикалийгидрофосфат либо соответствующие натриевые соли. Кроме того, культуральная среда должна содержать соли металлов, например, такие как сульфат магния или сульфат железа, которые необходимы для роста. И, наконец, в дополнение к вышеназванным соединениям могут использоваться такие важные для роста вещества, как аминокислоты и витамины. Кроме того, в культуральную среду могут быть добавлены соответствующие предшественники. Вышеуказанные добавки могут быть введены в культуральную среду в виде одноразовой добавки или добавляться соответствующим образом в процессе культивирования.

Для контроля значения рН культуральной среды используют соответственно либо основания, такие как гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак, либо кислоты, такие как фосфорная кислота или серная кислота. Для контроля пенообразования добавляют антивспениватели, например, такие как полигликолевые эфиры жирных кислот. Для поддержания стабильности плазмид могут быть добавлены соответствующие конкретной среде вещества, обладающие избирательным действием, например антибиотики. Для поддержания аэробных условий в культуру вводят кислород или содержащие кислород газовые смеси, например такие как воздух. Температура культуральной среды в норме находится в диапазоне от 20° С до 45° С и предпочтительно от 25° С до 40° С. Культивирование продолжают до тех пор, пока не образуется максимальное количество целевой L-аминокислоты. Как правило, на это требуется от 10 до 160 ч.

Анализ L-аминокислот можно проводить автоматически с помощью анионообменной хроматографии с последующей дериватизацией с использованием нингидрина по методу, описанному у Spackman и др. (Analytical Chemistry, 30, 1190 (1958)).

В соответствии с Будапештским договором в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zeilkulturen (DSMZ, Braunschweig, Германия)) депонированы следующие микроорганизмы:

- штамм Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pEK1,9gdh-1 под регистрационным номером DSM 12614;

- штамм Escherichia coli K-12 DH5α /pEKExpgdh под регистрационным номером DSM 12613.

Примеры

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах.

Для этой цели с использованием перечисленных ниже продуцирующих аминокислоты штаммов проводили опыты, в которых были подтверждены преимущества способа по изобретению:

а) продуцирующий L-лизин штамм Corynebacterium glutamicum DSM5715 (ЕР-В 0435132),

б) продуцирующий L-треонин и L-изолейцин штамм Brevibacterium flavum DSM5399 (ЕР-В 0385940) и

в) продуцирующий L-валин, нуждающийся в изолейцине штамм АТСС13032Δ ilvА, депонированный в соответствии с Будапештским договором в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур, Брауншвейг (Германия) под регистрационным номером DSM12455.

Пример 1

Получение продуцирующих L-аминокислоты штаммов с усиленной глютаматдегидрогеназой

Плазмида pEK1,9gdh-1 соответствует плазмиде pEK1,9gdh, описанной Bormann и др. (Molecular Microbiology 6, 317-326 (1992)). Ее выделяли из штамма ATCC13032/pEK1,9gdh-1. Аналогичным образом известную плазмиду pEKExpgdh (Marx и др., Metabolic Engineering I, 35-48 (1999)), которая несет ген глютаматдегидрогеназы из Peptostreptococcus asaccharolyticus (Snedecor и др., Journal of Bacteriology 173, 6162-6167 (1991)), выделяли из штамма Е.coli DH5a/pEKExpgdh.

Штаммы DSM5715, DSM5399 и ATCC13032Δ ilvA трансформировали плазмидой pEK1,9gdh-1 по методу, описанному у Liebl и др. (FEMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989)). Отбор трансформантов осуществляли на агаре со средой, используемой для инфузии в мозг и сердце, фирмы Merck (Darmstadt, Германия), дополненной 50 мг/л канамицина. Таким путем получали штаммы DSM5715/pEK1,9gdh-1, DSM5399/pEK1,9gdh-1 и ATCC13032Δ ilvA/pEK1,9gdh-1. Аналогичным образом штамм DSM5715 трансформировали плазмидой pEKExpgdh и получали штамм DSM5715/pEKExpgdh.

Пример 2

Получение L-лизина

Штамм DSM5715/pEK1,9gdh-1 предварительно культивировали в комплексной среде 2TY, состоящей из 16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl. Для этого в 60 мл среды 2TY, содержащейся в колбе Эрленмейера объемом 500 мл с 2 дефлекторами, с помощью петли для посева вносили штамм и культуру инкубировали в течение 12 ч при 150 об/мин и 30° С.

Предварительную культуру, предназначенную для инокуляции 60 мл среды, в которой получали продукт и которая содержалась в колбе Эрленмейера объемом 500 мл с 2 дефлекторами, центрифугировали в течение 10 мин при 5000 об/мин в мини-центрифуге типа Sepatech Minifuge RF (фирма Heraeus, Hanau, Германия). Надосадочную жидкость отбрасывали и дебрис ресуспендировали в 1 мл среды для получения продукта. Аликвотное количество этой суспензии клеток добавляли в среду, в которой получают продукт, так чтобы оптическая плотность ОП₆₀₀ составляла приблизительно 2,0. В качестве среды, в которой получают продукт, применяли описанную у Keilhauer и др. (Journal of Bacteriology 175, 5595-5603 (1993)) среду CGXII с рН 7,0 (таблица 1), дополненную 20 г/л глюкозы, 350 мг/л лейцина и 50 мг/л моносульфата канамицина. Культуры инкубировали в течение 72 ч при 30° С и 150 об/мин.

После этого определяли оптическую плотность (ОП) (прибор типа Biochrom Novaspec 4049, фирма LKB Instrument GmbH, Grafelfing, Германия) при длине волны 600 нм и концентрацию образовавшегося L-лизина с помощью анализатора аминокислот фирмы Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Германия) с использованием ионообменной хроматографии и реакции на последующих колонках с обнаружением нингидрином. В таблице 2 представлены результаты опыта.

Пример 3

Получение L-треонина и L-изолейцина

Штамм DSM5399/pEK1,9gdh-l предварительно культивировали в полной среде CgIII (Kase и Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36 (9), 1611-1621 (1972)) с добавлением 50 мкг/мл канамицина. Для этого в 10 мл среды CgIII, содержащейся в колбе Эрленмейера объемом 100 мл с 4 дефлекторами, с помощью петли для посева вносили штамм и культуру инкубировали в течение 16 ч при 240 об/мин и 30° С.

Определяли ОП (при длине волны 660 нм) предварительной культуры, предназначенной для инокуляции 10 мл среды, в которой получали продукт и которая содержалась в колбе Эрленмейера объемом 100 мл с 4 дефлекторами. Основную культуру засевали до получения значения ОП, равного 0,1. В качестве среды, в которой получают продукт, применяли описанную у Keilhauer и др. (Journal of Bacteriology 175, 5595-5603 (1993)) среду CgXII. Состав этой среды представлен в примере 2. Добавляли 4% глюкозы и 50 мг/л сульфата канамицина. Клетки инкубировали в течение 48 ч при 33° С, 250 об/мин и 80%-ной влажности воздуха.

После этого аналогично методу, описанному в примере 2, определяли оптическую плотность при 660 нм и концентрацию образовавшихся L-треонина и L-изолейцина. В таблице 3 представлены результаты опыта.

Пример 4

Получение L-валина

Штамм ATCC13032Δ ilvA/pEK1,9gdh-1 предварительно культивировали в полной среде CgIII (Kase и Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36 (9), 1611-1621 (1972)) с добавлением 50 мкг/мл канамицина. Для этого в 50 мл среды CgIII, содержащейся в колбе Эрленмейера объемом 500 мл с 4 дефлекторами, с помощью петли для посева вносили штамм и культуру инкубировали в течение 16 ч при 140 об/мин и 30° С.

Определяли ОП (при длине волны 660 нм) предварительной культуры, предназначенной для инокуляции 60 мл среды, в которой получали продукт и которая содержалась в колбе Эрленмейера объемом 500 мл с 4 дефлекторами. Основную культуру центрифугировали и отбрасывали надосадочную жидкость. Дебрис разбавляли в 5 мл среды, в которой получали продукт, и основную среду засевали до получения значения ОП, равного 0,3. В качестве среды для получения продукта применяли среду CgXII (Keilhauer и др.. Journal of Bacteriology 175, 5595-5603 (1993)), как описано в примере 3 (с добавлением 4% глюкозы). Клетки инкубировали в течение 48 ч при 30° С и 150 об/мин.

После этого аналогично методу, описанному в примере 2, определяли оптическую плотность при 660 нм и концентрацию образовавшегося L-валина. В таблице 4 представлены результаты опыта.

Пример 5

Получение L-лизина, L-валина и L-аланина

Штамм DSM5715/pEKExpgdh предварительно культивировали в комплексной среде 2TY, состоящей из 16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl. Для этого в 60 мг среды 2TY, содержащейся в колбе Эрленмейера объемом 500 мл с 2 дефлекторами, с помощью петли для посева вносили штамм и культуру инкубировали в течение 12 ч при 150 об/мин и 30° С.

Для инокуляции 60 мл среды для получения продукта, содержащейся в колбе Эрленмейера объемом 500 мл с 2 дефлекторами, предварительную культуру центрифугировали в течение 10 мин при 5000 об/мин в мини-центрифуге типа Sepatech Minifuge RF (фирма Heraeus, Hanau, Германия). Надосадочную жидкость отбрасывали и дебрис ресуспендировали в 1 мл среды для получения продукта. Аликвотное количество этой суспензии клеток добавляли в среду для получения продукта, так чтобы оптическая плотность ОП₆₀₀ составляла приблизительно 0,4. В качестве среды для получения продукта применяли описанную у Schrumpf и др. (Journal of Bacteriology 173, 4510-4516 (1991)) среду CGC (таблица 5), дополненную 25 г/л глюкозы, 350 мг/л лейцина и 42 мг/л 3-морфолинпропансульфоновой кислоты и 50 мг/л моносульфата канамицина с рН 7. Культуры инкубировали в течение 30 ч при 30° С и 150 об/мин.

После этого определяли оптическую плотность (ОП) (прибор типа Biochrom Novaspec 4049, фирма LKB Instrument GmbH, Grafelfing, Германия) при длине волны 600 нм и концентрацию образовавшихся L-аланина, L-лизина и L-валина с помощью анализатора аминокислот фирмы Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Германия) с использованием ионообменной хроматографии и реакции на последующих колонках с обнаружением нингидрином. В таблице 6 представлены результаты опыта.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. L-аминокислоты, такие как L-треонин, L-изолейцин, L-валин, L-триптофан и L-гомосерин получают путем ферментации с использованием коринебактерий, в которых сверхэкспрессируют нуклеотидную последовательность, кодирующую глютаматдегидрогеназу. Данное изобретение позволяет увеличить выход указанных аминокислот. 8 з.п. ф-лы, 6 табл.

Формула