Способ получения биологически активного комплекса @ 6049 и штамм @ @ @ . @ . 6049-продуцент биологически активного комплекса @ 6049 - SU1308200A3

Описание

(21)3598051/28-14

(22)23.05.83

(31)8215123

(32)24.05.82

(33)JP

(46) 30.04.87. Бюл. № 16

(71)Фудзисава Фармасьютикал Ко., Лтд

(JP)

(72)Сумио Киюото, Мотоаки Нисикава, Морита Ивами, Хироси Терано, Масаноби Кохсака и Хироси Иманака (JP) (53) 615-779.9(088.8)

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСА WS 6049 И ШТАММ ACTINOMADURA PULVERACENS SP. NOV 6049ПРОДУЦЕНТ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСА WS 6049

(57) Изобретение выявляет штамм-продуцент , который позволяет получить вещества, обладающие противомикробными и противоопухолевыми свойствами . Штамм (Ш) Actinomadura pulveracens Sp. nov 6049 выделен из образца почвы,собранной в г. Вакаяма, Япония .Ш депонирован в американской коллекции типовых культур под номером АТСС 39100 и характеризуется соответствующими физиолого-биохимическими признаками. Для получения биологически активного комплекса WS 6049 Ш Actinomadura pulveracens Sp. nov 6049 культивируют в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей 4% сахарозы, 0,5% сухих дрожжей; 0,1% KjHPO ; 0,1 гептагидрата сульфата магния, 0,1% хлористого натрия-, О ,2% сульфата аммония; 0,2% карбоната кальция-, 0,0001% гептагидрата сульфата железа; 0,0001% тетрагидрата хлористого марганца; 0,0001% гептагидрата сульфата цинка и 0,00005% йодистого натрия, при в течение 4 сут при перемешивании. Мицелий экстрагируют этилацетатом, экстракты промывают 1%-ным бикарбонатом натрия и 10%-ным хлористым натрием. Экстракты концентрируют в вакууме, дегидратированный концентрат хроматографируют, колонку промывают хлороформом и элюи-- руют смесью хлороформа и метанола 40:1. Фракции вакуумируют, полученный порошок растворяют в хлороформе и хроматографируют, промывают смесью хлороформ:ацетон (8:1), вещество WS 6049А элюируют смесью хлороформ: ацетон (4:1), вещество WS 6049 В злюируют смесью хлороформ:ацетон (2:1). Изобретение относится к микробиологии и касается получения биологически активных веществ, обладающих антимикробной и противоопухолевой ак тивностью. Целью изобретения является выявление штамма-продуцента, способного образовывать биологически активное вещество, и разработка способа его получения, что позволит расширить ар сенал противомикробных и противоопухолевых лекарственных средств. Штамм Actinoraadura pulveracens sp nov. 6049 выделен из образца почвы, собранной в г. Вакаяма, Япония. Штамм депонирован в Американской Коллекции типовых культур под номером АТСС 39100 и характеризуется сле дующими признаками. Культурально-морфологические признаки . Агар с овсяной мукой - воздушный мицелий зеленовато-белый, цветовая характеристика дана на основе Color Standart (Нихон Сикисаи Ко., Лтд), субстратный мицелий бесцветный, раст Еоримьш пигмент отсутствует. Агар с дрожжевым и солодовым зкстрактами - воздушный мицелий бледноголубой , субстратньй мицелий бледножелтый , растворимый пигмент отсутствует . Агар с минераль 1ыми солями и крах малом - воздушный мицелий белый, суб сгратный мицелий светло-красньш, рас вэримый пигмент отсутствует. Глюкозо-аспарагиновый агар - воздушный мицелий отсутствует, субстрат ный мицелий розовый, растворимый пигмент отсутствует. Глицерино-аспарагиновый агар - в душный мицелий следы, субстратный ми бледно-розовый, растворимый пигмент отсутствует. Сахарозо-нитратный агар - воздушный мицелий отсутствует, субстратный М1 целий бледно-розовый, растворимый пкгмент отсутствует. Питательньм агар - воздушный мицелий отсутствует, субстратный мице лий светло-красный, растворимый пиг мент отсутствует. Картофельно-декстрозный агар воздушный мицелий отсутствует, субстратный мицелий бледно-розовый, растворимый пигмент отсутствует. бледно-розовый, растворимый пигмент отсутствует. Физиолого-биохимические признаки. Температурный интервал роста 2041°С , оптимальная температура 30-35°С. Интервал рН для роста 6-10, оптимальная величина рН 7-8. Нитраты в нитриты не восстанавливает . Крахмал гидролизует. Слабо коагулирует молоко, не пептонизирует. Желатин разжижает. Меланин не образует . Сероводород не образует. Проба на уреазу отрицательная. Из источников углерода хорошо усваивает D-ксилозу, рамнозу, П-глюкозу , сахарозу; слабо усваивает глицерин , мальтозу, D-инозит, D-галактозу, не усваивает-цитрат натрия, лактозу, D-фруктозу, сукцинат натрия, инулин, раффинозу, о -арабинозу, маннит, Dманнозу , целлюлозу, D-трегалозу, салицин , хитин, ацетат натрия. Из источников азота усваивает дрожжевой экстракт, пептон, клейковинную муку, муку из семян хлопка, осевую муку, кукурузную вытяжку, сушеные дрожжи, пшеничные зародыши, аммониевые соли, мочевину, аминокислоты и другие. Способ с использованием предлагаемого штамма иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Водную среду (160 мл), содержащую, %: крахмал 2, i глюкозу 0,5, мука семян хлопка t, высушенные дрожжи 1., кукурузная вытяжка 0,5 и карбонат кальция (рН 7,0) 0,2, наливают в каждую из трех колб Эрленмейера емкостью 500 мл и стерилизуют при в течение 30 мин. Петлю скошенной культуры микроорганизма Actinomadura pulveracens sp. nov. № 6049 (АТСС 39100) инкулируют в каждую из сред и культивируют при 30°С на вращающемся встряхивателе с размахом в 3 дюйма (7 ,62 см) при 220 об/мин в течение 4 сут. Полученную в результате культуру инокулируют в водную среду (20 л), содержащую, %: сахароза 0,2, сухие дрожжи 0,5, KjHPO Ь,1 , гептагидрат сульфата магния 0,1, хлористый натрий 0,1, сульфата аммония 0,2, карбонат кальция 0,2, гептагидрат сульфата железа 0,0001, тетрагидрат хлористого марганца 0,0001, гептагидрат сульфата цинка 0,0001 и йодистый натрий 0,00005, в 30-литровой емкости для ферментации , которую предварительно стерилизуют при 120С в течение 30 мин,и культивируют при 30°С в течение 4 с при аэрировании с использованием 20 л в минуту и при перемешивании при 300 об/мин. Полученную культуральную жидкост фильтруют с помощью диатомовой земли (1 кг). К полученному мицелию добавляют 10 л этилацетата, перемешивают в течение 10 мин. Экстрагиро вание осуществляют два раза и экстракты объединяют. Экстракты промывают 10 л 1%-ного бикарбоната натри и 10 л 10%-ного хлористого натрия. Затем экстракты концентрируют в вакууме до объема в 1 л. После дегидратации безводным сульфатом натрия этилацетатный раствор далее концент рируют в вакууме и полученные маслянистые вещества наносят на хроматографическую колонну с использованием силикагеля (70 мл). Колонку пр мывают 200 мл хлороформа и элюируют смесью хлороформа и метанола (40:1) Фракции, содержащие активные вещест ва (500 мл), концентрируют в вакууме , получая неочищенный порошок ( 140 мг). Порошок растворяют в 2 мл хлороформа и подвергают колоночной хроматографии на силикагеле (20 мл). Колонку промывают смесью хлороформ: ацетон (8:1) и вещество WS 6049-А элюируют смесью хлороформ:ацетон (4:1). Вещество WS 6049-В элюируют смесью хлороформ:ацетон (2:1). Каждую из фракций, содержащих WS 6049-А и WS 6049-В, концентрирую

в вакууме, получая неочищенный порошок вещества WS 6049-А (17 мг) и WS 6049-В (15 мг), соответственно. Их отдельно подвергают жидкостной хроматографии высокой разрешающей способности (НР1 С). Хроматографию контролируют с помощью УФ-детектора . Используют стальную колонку (внутренний диаметр - 7,9 мм, длина 300 мм) , наполненная LL порасилом со скоростью потока 3 мл/мин. Используемая подвижная фаза представляет собой смесь гексана, хлороформа и метанола (25:10:2). HPL С при упомянутьгх вьпие условиях дает фракцию А (время удерживания 18 мин) и фракцию В (время удерживания 26 мин). Получают 12 мг бесцветного порошка вещества WS 6049-А из фракции А и 8 мг бесСтационарная фаза:

Rf 0,59 (силикагель/хлороформ: метанол силикагелевая пластина: 10:1 (об/об));

Rf 0,33 (хлороформ:ацетон 1:1 об/об).

Молекулярный вес: FD. Масс: m/z 1333 (), F ABQMe:m/z 1311 ().

Хроматография гельпроникновения: 1100-1200.

13С Спектр ядерно-магнитноrd резонанса (CDClj) (млн.дол.): 13,9; 14.6; 16,7; 17,6; 19,9; 22,8; 29,1; 34,0; 35,2; 39,6; 42,3; 52,7; 55,8; 56,1; 56,2; 56,-2; 60,3; 61,7; 64,7; 66,7; 68,4; 69,0; 69,3; 69,8; 70,5; 72,0; 75,9; 76,1; 77,2; 77,3; 83,2; 86,3; 88,5; 90,7; 97,3; 98,6; ; 98,9; 99,6; 99,7; 103,9; 107,8; 112,7; цветного порошка вещества WS 6049-В из фракции В. Физические и химические свойства вещества WS 6049. Вещество WS 6049 состоит из вещества WS 6049-А и WS 6049-В, которые имеют следующие характеристики. WS 6049-А - бесцветный порошок. Дает положительную реакцию Драгендорфа, Эрлиха и с сульфатом церия и отрицательную реакцию с нингидрином. Растворяется в метаноле, ацетоне, хлороформе, слабо растворяется в диэтиловом эфире, не растворяется в гексане , воде.Т.пл. (разложение). Удельное вращение: (o)jj -208(С 1,0, сне). Спектр ультрафиолетового поглощения: Л;Г 252НМ(Е,560); 280 им (E:|;/ 370); 320 им (Е 220). СНзОН+НСе 252,280,320 нм. ,.CH,OH+NaOH . „„.. -,,п / мокс 280,310 (плечо) нм. Спектр инфракрасного поглощения: мй 3450, 3350, 3250, 2960, 920, 1725, 1675, 1610, 1595, 1520, 1465, 1450, 1405, 1370, 1350, 1310, 1250, 1180, 1155, 1115 1075, 1020, 985, 955, 905, 850 см- С 52,03%, Н 5,71%, N 4,15%, S , 86%. 130 123,2; 125,0; 130,0; 130,0; 131,1; 136,8; 144,2; 146,6; 154,0; 154,6; 160,9; 166,6; 192,4. 1Н спектр ядерномагнитного резонан са (CDClj):(млн.доля): 8,57 (1Н, с), 7,48 (1Н, с), 6,6 (Тн, .), 6,2 (( Н, д. , : 1,6 Гц), 6,18 (1Н, широкий с.), 5,93 (1Н, д., : 9,6 Гц) 5,83 (1Н, д.д.), 3 9,6, 1,6 Гц), 5,7 (1Н, д. , Гц), 5,6 (1Н, м.) 5,48 (1Н, д., J 2,3 Гц), 5,43 (1Н, широкий синглет), 4,97 (1Н, дублет), 4,7 (2Н, мультиплет), 4,56 (1Н, дублет , J 2,3 Гц), 4,23 (1Н, синглет) 4,2-3,6 (10-14 Н), 3,97 (ЗН, синглет 3,88 (ЗН, синглет), 3,79 (ЗН), синглет ), 3,5 (2Н, мультиплет), 3,43 (ЗН, синглет), 2,77 (1Н, синглет), 2,7 (2Н, мультиплет),2,52 (ЗН, синглет ), 2,5 (Ш), синглет), 2,7 (2Н, мультиплет), 2,52 (ЗН, синглет), 2,5 (1Н, мультиплет), 2,4-2,25 (ЗН, муль типлет), 2,17 (1Н, синглет), 2,12 (ЗН, синглет), 2,07 (1Н, мультиплет) 1,77 (2Н, синглет), 1,5 (2Н, мультиплет ), Т,41 (ЗН, дублет, D 6 Гц), 1,35 (ЗН, дублет, Л 6 Гц), 1,32 (ЗН, дублет, J 6 Гц), 1,2 (4Н,муль типпет). WS 6049-В. Бесцветный порошок. По ложительная реакция Драгёндорфа, реакция Эрлихта и реакция сульфата церия . Отрицательная: реакция ингидрина . Растворимо в метаноле, ацетоне, хлороформе, плохо растворимо в диэти ловом эфире. Не растворимо в гексане Т.пл.:145С (разложение). Удельное вращение: (d) -201 ( с 1,0, CHCKj). Спектр ультрафиолетового поглощения : 253 нм (EV 620). 280 нм (.11° 450) 320 нм (Е 250) нее 253, 280, 320 нм; max .СНзОН. 250, 282, 310 (плечо) нм. Спектр инфракрасного поглощения: 3450, 3350, 3250, 2990, 2920, 1725, 1675, 1610, 1595, 1520, 1465, 1450, 1405, 1370, 1350, 1310, 1250, 1180, 1155, 1115, 1075, 1020, 985, 955, 905, 880, 850 см . 6 Тонко-слойиая хроматография: Стационарная фаза: проявляющий астворитель Rf величина хлороформ: етанол (10:1) 0,53 (об/об), Силикагельный лист хлороформ: цетон (1:1) 0,18 (об/об). Молекулярый вес. Хроматография гель проникновения: 100-1200, 13 С Спектр ядерно-магнитного реонанса (); (млн.доля.): 13,8, 16,7, 17,6, 19,8, 22,7, 29,1, 33,9, 4,1, 35,2, 39,5, 52,8, 55,8, 56,1, 56,3, 61,0 61,5, 64,6, 66,7, 68,4, 69,0, 69,3, 69,8, 70,4, 71,9, 75,9, 76,2, 76,7, 77,2, 77,3, 77,6, 83,2, 86,6, 88,3, 90,7, 97,3, 9.8,6, 99,0, 99,6, 99,7, 1-03,9, 107,8, 112,7, 123,2, 124,9, 129,8, 131,0, 136,8, 144,2, 146,3, 154,0, 154,6, 160,9, 166,6, 192,4. 1Н Спектр ядерно-магнитного резонанса (CDClj): (Г (млн. доля.): 11,75, (1Н, синглет), 8,57 (1Н, синглет ), 7,48 (1Н, синглет), 6,6 (1Н, двойной дублет), 6,24 (1Н, дублет, 3 1,3 Гц), 6,18 (1Н, широкий синглет ), 5,93 (1Н, дублет, 3- 9,2 Гц), 5,83 (1Н, двойной дублет, 3 9 Гц и 1,3 Гц), 5,70 (1Н, широкий дублет), 5,5 (1Н, мультиплет), 5,47 (1Н, дублет , ,3 Гц), 5,42 (1Н, широкий синглет), 4,98 (ТН, дублет, 3 9 Гц), 4,70-4,6 (2Н, мультиплет), 4,56 (1Н, дублет, .3 2,3 Гц), 4,24 (1Н, синглет ), 4,15-3,4 (12-18Н), 3,97 (ЗН, синглет), 3,88 (ЗН, синглет), 3,79 (ЗН, синглет), 3,42 (ЗН, синглет), 2,52 (ЗН, синглет), 2,6-2,4 (2Н, мультиплет ), 2,4-2,2 (7-8 Н), 2,12 (ЗН, синглет), 2,2-2,0 (2Н, мультиплет), 1,5 (2Н, мультиплет), 1,4 (ЗН, дублет , D 6,Гц), 1,35 (ЗН, дублет, D 6 Гц) , 1,33 (ЗН, дублет, J 6 Гц), как показано на фиг. 4. Биологические свойства веществ WS 6049. Противоопухолевая активность веществ WS 6049. Противоопухолевая активность веществ WS 6049 определялась в экспериментальной опухолевой системе на мышах . Лимфоцитарная лейкемия Р-388 имп- лантировалась интраперитонеально мышцам BDF 1 при размере инокулюма 1 10 клеток на мышь. Через 24 ч имплантации опухолевых клеток мышам интраперитонеально (внутрибрюшннно) вводят постепенно увеличивающиеся дозы антибиотиков . Обработка производится на 1-4-й день.

Вещества WS 6049 суспендируют в физиологическом солевом растворе (0,9%). Контрольные животные получают интраперитонеальные дозы физиологического солевого раствора. Объем инъекции составляет 0,2 мл во всех экспериментах.

Терапевтические ответные реакции измерялись по среднему времени выживания , а результаты выражались как Т/С% (время вьгаивания обработанной группы, деленное на время выживания контрольной группы и умноженное на 100). Токсичность измерялась как потеря веса между днями О и 4 после инокуляции опухоли.

Вещества У5 6049-А и WS 6049-В активны против лейкемии Р-388. Дозы 0,025-12,0 мкг/кг приводят к значительному увеличению продолжительности жизни у мышей.

Противомикробная активность веществ WS 6049-А и WS 6049-В.

Противомикробную активность веществ WS 6049-А и WS 6049-В определяют методом серийного разведения в бульоне для бактерий и в среде Сабуро для грибков и дрожжей. Минимальные ингибирующие концентрации (МТС) выражались в мкг/мл после инкубирования в течение ночи при 37°С для бактерий , и 48-72 ч инкубирования при 28°С для грибков и дрожжей. Противомикробные спектры веществ WS 6049-А и WS 6049-В показаны в таблице.

Реферат

Формула