Продуцирование aav в клетках насекомых, способы и композиции для этого - RU2018128968A
Код документа: RU2018128968A
Формула
1. Бакуловирусный вектор, содержащий:
кассету экспрессии AAV Сар;
кассету экспрессии AAV Rep; и
гомологичную область (hr) бакуловируса, расположенную примерно на расстоянии до около 4 тыс. п.о. от стартового кодона кассеты экспрессии AAV.
2. Вектор по п. 1, содержащий в направлении 5'-3' кассету экспрессии Сар, кассету экспрессии Rep и гомологичную область (hr) бакуловируса.
3. Вектор по п. 1, содержащий в направлении 5'-3' кассету экспрессии Rep, кассету экспрессии Сар и гомологичную область (hr) бакуловируса.
4. Вектор по п. 1, содержащий в направлении 5'-3' кассету экспрессии Сар, гомологичную область (hr) бакуловируса и кассету экспрессии Rep.
5. Вектор по п. 1, содержащий в направлении 5'-3' кассету экспрессии Rep, гомологичную область (hr) бакуловируса и кассету экспрессии Сар.
6. Вектор по п. 1, содержащий в направлении 5'-3' гомологичную область (hr) бакуловируса, кассету экспрессии Сар и кассету экспрессии Rep.
7. Вектор по п. 1, содержащий в направлении 5'-3' гомологичную область (hr) бакуловируса, кассету экспрессии Rep и кассету экспрессии Сар.
8. Вектор по п. 1, в котором область hr находится между кассетой экспрессии Rep и кассетой экспрессии Сар, и в котором кассета экспрессии Rep и кассета экспрессии Сар находятся в ориентации голова-к-голове (5'-5').
9. Вектор по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что гомологичная область бакуловируса представляет собой последовательность hr2.
10. Вектор по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что вектор не содержит Rep-связывающий элемент (RBE).
11. Линия клеток насекомых, содержащая клетки, содержащие вектор по любому из пп. 1-10.
12. Линия клеток насекомых по п. 11, отличающаяся тем, что указанные клетки дополнительно содержат второй вектор, причем указанный второй вектор содержит трансген, фланкированный ITR AAV.
13. Способ выращивания бакуловируса in vitro, включающий:
обеспечение культуры клеток насекомых по п. 11 или по п. 12; и
инкубирование клеток.
14. Способ по п. 13, в котором инкубация клеток включает в себя пассирование клеток, причем выход продукции AAV в пассаже 7 является по меньшей мере в 2 раза большим по сравнению с контрольной линией клеток насекомых, содержащей бакуловирусный вектор, содержащий кассету экспрессии AAV Сар и кассету экспрессии AAV Rep, но не содержащий hr бакуловируса.
15. Способ по п. 13, в котором в пассаже 7 титр бакуловируса, содержащего кассету экспрессии AAV Сар, составляет более 21,5% от общего титра бакуловируса.
16. Способ выращивания AAV in vitro, включающий:
обеспечение культуры клеток насекомых;
инфицирование или трансфекцию клеток насекомых бакуловирусным вектором по любому из пп. 1-10; и
инкубирование клеток.
17. Способ по п. 16, в котором в Р7 выход AAV из клеток насекомых по меньшей мере на 50% превышает выход AAV в Р7 из клеток насекомых, содержащих бакуловирусный вектор без hr.
18. Способ по п. 16, в котором в Р7 выход AAV из клеток, содержащих hr бакуловируса, по меньшей мере на 20% превышает выход AAV из клеток, содержащих бакуловирусный вектор без hr.
19. Способ по п. 16, в котором бакуловирусный вектор не содержит Rep-связывающий элемент (RBE).
20. Способ продуцирования AAV in vitro, включающий выращивание культуры клеток насекомых, содержащей вектор по любому из пп. 1-10, и вектор, содержащий трансген, фланкированный AAV ITR.
21. Бакуловирусный вектор без Rep-связывающего элемента (RBE) для продуцирования AAV в клетках насекомых in vitro, содержащий:
кассету экспрессии AAV Сар;
кассету экспрессии AAV Rep; и
гомологичную область (hr) бакуловируса, расположенную примерно на расстоянии до около 4 тыс. п.о. от стартового кодона кассеты экспрессии AAV.
