Липосомальная композиция и фармацевтическая композиция - RU2734900C1

Чертежи

Описание

Предпосылки создания изобретения

1. Область техники, к которой относится изобретение

[0001] Настоящее изобретение относится к липосомальной композиции и фармацевтической композиции, которые демонстрируют высокое удержание в крови.

2. Описание предшествующего уровня техники

[0002] результаты исследований часто показывают, что лекарственное средство аккумулируется на участке заболевания, такого как рак, и воздействует на него в течение долгого периода времени при помощи липосомальной композиции. В липосомальной композиции, в качестве фармацевтической композиции, лекарственное средство инкапсулировано в липосому, образованную из липидной мембраны.

[0003] US7060828B2 и [AACR–EORTC International Conference, San Francisco, California, October 22–26, 2007, #C113 A Pharmacokinetics Study of a Novel Sphingomyelin/Cholesterol Liposomal Topotecan and Non–Liposomal Topotecan in Rats, William C. Zamboni et al.] раскрывают липосому, где топотекан инкапсулирован в липосому, содержащую сфингомиелин и холестерин.

US7811602B2 раскрывает липосому, где топотекан инкапсулирован в липосому, содержащую дигидросфингомиелин и холестерин.

[0004] JP2008–519045A раскрывает липосомальную композицию, содержащую камптотецин, для повышения стабильности камптотецина, включающую (a) камптотецин, инкапсулированный в липосому, (b) первый раствор, который является внешним по отношению к липосоме и имеет pH 4,5 или меньше чем 4,5, и (c) второй раствор, который является внутренним по отношению к липосоме. Также раскрывается, что липосома содержит дигидросфингомиелин и холестерин.

[0005] JP1990–196713A (JP–H02–196713A) раскрывает систему для эффективной загрузки амфифильного лекарственного средства в липосому, включающую доведение липосомальной суспензии в присутствии аммониевого соединения или аммониевой соли, разбавление суспензии буфером или солью и обеспечение градиента аммония изнутри наружу между внутренней водной фазой и внешней водной фазой и градиента pH так, чтобы pH внутри липосомы был более кислотным, чем pH снаружи липосомы.

[0006] US6355268B2 раскрывает липосому, где топотекан инкапсулирован в присутствии сульфата аммония в липосому, содержащую очищенный гидрогенизированный соевый фосфолипид или сфингомиелин, холестерин и являющийся производным гидрофильного полимера липид.

Сущность изобретения

[0009] Указанные выше US7060828B2, US7811602B2, JP2008–519045A и [AACR–EORTC International Conference, San Francisco, California, October 22–26, 2007, #C113 A Pharmacokinetics Study of a Novel Sphingomyelin/Cholesterol Liposomal Topotecan and Non–Liposomal Topotecan in Rats, William C. Zamboni et al.] раскрывают, что эффективность лекарственного средства улучшается при инкапсулировании топотекана в липосому, содержащую сфингомиелин или дигидросфингомиелин для подавления просачивания топотекана в кровь и улучшения значения площади под кривой концентрация в крови–время (AUC). Однако, поскольку композиция липидов, которые образуют липосому, и композиция солей, которые осаждают топотекан, не были оптимизированы, улучшение AUC не является достаточным, и поэтому необходимо дальнейшее улучшение AUC.

[0010] Кроме того, в случае, когда топотекан просачивается из внутренней водной фазы липосомы во внешнюю водную фазу и затем подвергается воздействию нейтральных условий, топотекан превращается в его аналоги. В частности, N–N–бис аддукт с чрезвычайно низкой растворимостью (димер топотеканамина) или т.п. может осаждаться в виде кристаллов. В конечном итоге образуется много нерастворимых частиц, которые отклоняются от стандартов безопасности и качества, определенных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA), Японским агентством по фармацевтическим и медицинским приборам (PMDA) и Европейским агентством по лекарственным средствам (EMEA), что поэтому нежелательно. Чтобы подавить образование таких нерастворимых частиц, pH внешней водной фазы устанавливается на кислотном уровне в JP2008–519045A. Однако в случае, когда внешняя водная фаза находится в кислотном состоянии, ускоряется разложение липидов, составляющих липосому, что является неблагоприятным для стабилизации липосомы. В липосому JP2008–519045A, поскольку необходимо подкислить внешнюю водную фазу, трудно добавить кислотно–гидролизуемый метоксиполиэтиленгликоль–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин для улучшения удержания в крови.

[0011] Целью настоящего изобретения является обеспечение липосомальной композиции и фармацевтической композиции, которые демонстрируют высокое значение AUC.

[0012] В результате глубоких исследований для достижения указанной цели авторы настоящего изобретения обнаружили, что можно обеспечить липосомальную композицию, которая достигает указанной цели, посредством такой конфигурации, где гидрофильный полимер–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин, дигидросфингомиелин и холестерины используются в качестве компонентов липосомальной мембраны, ее внутренняя водная фаза содержит сульфат аммония, и молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом установлено как равное 0,36 или больше. Настоящее изобретение было создано на основании этих открытий.

[0013] Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает следующее.

[1] Липосомальная композиция, включающая: гидрофильный полимер–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин; дигидросфингомиелин; и холестерины в качестве компонентов липосомальной мембраны, где липосомальная композиция инкапсулирует лекарственное средство, ее внутренняя водная фаза содержит сульфат аммония, и молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом составляет 0,36 или больше.

[2] Липосомальная композиция в соответствии с [1], в которой лекарственное средство представляет собой топотекан или его соль, доксорубицин или его соль, иринотекан или его соль или сунитиниб или его соль.

[3] Липосомальная композиция в соответствии с [1] или [2], в которой молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом составляет 0,6 или больше и 1,8 или меньше.

[4] Липосомальная композиция в соответствии с любым из [1] – [3], в которой гидрофильный полимер–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин представляет собой полиэтиленгликоль– или метокси полиэтиленгликоль–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин.

[5] Липосомальная композиция в соответствии с любым из [1] – [4], в которой процентное содержание гидрофильный полимер–модифицированного диацилфосфатидилэтаноламина в компонентах липосомальной мембраны составляет от 2 до 10 моль%.

[6] Липосомальная композиция в соответствии с любым из [1] – [5], в которой процентное содержание холестеринов в компонентах липосомальной мембраны составляет от 35 до 43 моль%.

[7] Липосомальная композиция в соответствии с любым из [1] – [6], которая имеет размер частиц 150 нм или меньше.

[8] Липосомальная композиция в соответствии с любым из [1] – [7], в которой внешняя водная фаза имеет pH 5,5–8,5.

[9] Липосомальная композиция в соответствии с любым из [1] – [8], в которой дигидросфингомиелин представляет собой дигидросфингомиелин, имеющий длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 16 атомов углерода, и длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 18 атомов углерода, и инкапсулированное лекарственное средство представляет собой топотекан или его соль.

[10] Липосомальная композиция в соответствии с любым из [1] – [9], в которой процент сульфат–ионов, содержащихся во внутренней водной фазе липосомы, относительно сульфат–ионов в липосомальной композиции в целом составляет по меньшей мере 80%, и процент лекарственного средства, содержащегося во внутренней водной фазе липосомы, относительно лекарственного средства в липосомальной композиции в целом составляет по меньшей мере 80%.

[11] Липосомальная композиция в соответствии с [9], в которой скорость высвобождения лекарственного средства из липосомы в плазме, имеющей концентрацию аммония 1 ммоль/л или меньше, составляет 20%/24 часа или меньше при 37°C, и скорость высвобождения лекарственного средства из липосомы в плазме, имеющей концентрацию аммония 4–6 ммоль/л составляет 60%/24 часа или больше при 37°C.

[12] Липосомальная композиция в соответствии с любым из [1] – [11], в которой количество частиц больше чем 10 мкм, содержащихся в 1 мкмоль липида липосомальной композиции после хранения в течение 1 месяца при 5°C, составляет 150 или меньше, и количество частиц больше чем 25 мкм, содержащихся в 1 мкмоль липида липосомальной композиции, составляет 15 или меньше.

[13] Фармацевтическая композиция, включающая:

липосомальную композицию в соответствии с любым из [1] – [12].

[14] Фармацевтическая композиция в соответствии с [13], которая представляет собой противораковое средство.

[15] Липосомальная композиция, включающая: гидрофильный полимер–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин; дигидросфингомиелин; и холестерины в качестве компонентов липосомальной мембраны, где липосомальная композиция инкапсулирует лекарственное средство, ее внутренняя водная фаза содержит сульфат аммония, и дигидросфингомиелин представляет собой дигидросфингомиелин, имеющий длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 16 атомов углерода, и длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 18 атомов углерода.

[0014] [A] Способ лечения заболевания, включающий введение субъекту липосомальной композиции, включающей гидрофильный полимер–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин, дигидросфингомиелин и холестерины в качестве компонентов липосомальной мембраны, где липосомальная композиция инкапсулирует лекарственное средство, ее внутренняя водная фаза содержит сульфат аммония, и молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом составляет 0,36 или больше.

[B] Липосомальная композиция для применения в лечении заболевания (предпочтительно рака), включающая гидрофильный полимер–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин, дигидросфингомиелин и холестерины в качестве компонентов липосомальной мембраны, где липосомальная композиция инкапсулирует лекарственное средство, ее внутренняя водная фаза содержит сульфат аммония, и молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом составляет 0,36 или больше.

[C] Применение липосомальной композиции для получения фармацевтической композиции, включающей гидрофильный полимер–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин, дигидросфингомиелин и холестерины, где липосомальная композиция инкапсулирует лекарственное средство, ее внутренняя водная фаза содержит сульфат аммония, и молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом составляет 0,36 или больше.

[0015] Липосомальная композиция и фармацевтическая композиция по настоящему изобретению могут демонстрировать высокое значение AUC.

Краткое описание чертежей

[0016] Фиг. 1 показывает результаты измерения массы тела в испытании эффективности лекарственного средства с использованием мышиной модели подкожной трансплантации A549.

Фиг. 2 показывает результаты измерения массы тела в испытании эффективности лекарственного средства с использованием мышиной модели подкожной трансплантации A549.

Фиг. 3 показывает результаты измерения объема опухоли в испытании эффективности лекарственного средства с использованием мышиной модели подкожной трансплантации A549.

Фиг. 4 показывает результаты измерения объема опухоли в испытании эффективности лекарственного средства с использованием мышиной модели подкожной трансплантации A549.

Фиг. 5 показывает значение AUC для каждого количества холестерина.

Фиг. 6 показывает результаты измерения зависимости ионов аммония от скорости высвобождения.

Описание предпочтительных вариантов осуществления

[0017] Числовой диапазон, указанный с использованием “до” в настоящем описании, означает диапазон, включающий числовые значения, описанные до и после “до” в качестве минимального значения и максимального значения, соответственно.

Что касается содержания компонента в композиции, в случае, когда существует множество веществ, соответствующих компоненту в композиции, под содержанием подразумевается, если не указано иное, общее количество множества веществ, присутствующих в композиции.

[0018] Термин “удержание в крови” означает свойство, когда лекарственное средство в инкапсулированном в липосому состоянии присутствует в крови у субъекта, которому введена липосомальная композиция.

[0019] “Средний размер частиц липосомы” означает совокупный средний размер частиц, измеренный с использованием метода динамического рассеяния света, если не указано иное. Примеры коммерчески доступных измерительных устройств, использующих динамическое рассеяние света, включают анализатор размера частиц в концентрированных системах FPAR–1000 (производства Otsuka Electronics Co., Ltd.), NANOTRAC UPA (изготовитель Nikkiso Co., Ltd.) и NANOSIZER (изготовитель Malvern Panalytical Ltd.). Также можно рассчитать среднеобъемный размер частиц и среднечисленный размер частиц липосомы, используя уравнение преобразования, специфическое для измерительного устройства каждого изготовителя.

Чтобы измерить частицы примерно около 100 нм, распределение частиц не может быть точно зафиксировано методом статического рассеяния света или подобным, и измерение методом динамического рассеяния света является предпочтительным.

[0020] Термин “нерастворимые частицы” означает позицию, установленную регулирующими органами, такими как PMDA, FDA и EMEA, в стандартах безопасности и качества лекарственных композиций для системного введения, таких как композиции для внутривенных инъекций. Например, в случае оценки фармацевтической композиции по первому методу (метод светоблокировки для подсчета частиц) Метода Испытаний Нерастворимых Частиц Японской Фармакопеи <6.07> Инъекции в Японии, требуется, чтобы количество нерастворимых частиц, имеющих размер частиц 10 мкм или более, содержащихся в одном флаконе лекарственного средства для продукта, имеющего воспроизводимый объем менее 100 мл, составляло 6000 или меньше, а количество нерастворимых частиц, имеющих размер частиц 25 мкм или более, составлядо 600 или меньше. Кроме того, в случае оценки фармацевтической композиции вторым методом (метод подсчета частиц под микроскопом) требуется, чтобы количество нерастворимых частиц, имеющих размер частиц 10 мкм или более, составляло 6000 или меньше, а количество нерастворимых частиц с размером частиц 25 мкм или более составляло 600 или меньше.

[0021] Нерастворимые частицы определяются только по размеру частиц, независимо от компонентов частиц. Например, в липосомальной композиции нерастворимые частицы могут представлять собой агрегаты самих липосом, агрегаты и осадки компонентов лекарственного средства, просочившиеся изнутри липосом, или агрегаты и осадки компонентов внешней водной фазы липосом. В частности, в соответствии с описанием JP2008–519045A и т.д., известно, что липосома с инкапсулированным топотеканом в данном изобретении представляет собой осадок, который образуется в результате вытекания инкапсулированного топотекана наружу из липосомы с последующим разложением на менее растворимый деградант.

[0022] В качестве способа измерения нерастворимых частиц существует, например, метод светоблокировки для подсчета частиц, основанный на оптической детекции нерастворимых частиц (счетчик частиц, например, HIAC 9703+ от Beckman Coulter, Inc. или Accusizer A2000 USP от Particle Sizing Systems, Inc.), и метод подсчета частиц с использованием микроскопа, в котором осуществляют визуальное наблюдение увеличенного изображения под микроскопом и подсчитывают нерастворимые частицы.

В случае липосомальной фармацевтической композиции, особенно в случае инъекционной композиции, предпочтительно, чтобы, как определено в Методе Испытания Нерастворимых Частиц в Японской Фармакопее <6.07> Инъекции, количество частиц, имеющих размер частиц более чем 10 мкм, которые содержатся в фармацевтической композиции во время использования, составляло 6000 или меньше, а количество частиц, имеющих размер частиц более 25 мкм, составляло 600 или меньше.

В инъекционной лекарственной форме липосомальной фармацевтической композиции причина образования нерастворимых частиц, как полагают, объясняется главным образом агрегацией, коалесценцией и разложением компонентов липосомных частиц, которые происходят во время хранения, но не ограничивается этим. Нерастворимые частицы имеют тенденцию образовываться в зависимости от количества липида, который является основным материалом, составляющим липосому. Например, в случае рассмотрения фармацевтической композиции, содержащей 2 мл липосомальной композиции, имеющей концентрацию липидов 20 ммоль/л, и затем в случае, когда количество частиц, имеющих размер частиц более 10 мкм, составляет 150 или меньше, а количество частиц, имеющих размер частиц более 25 мкм, составляет 15 или меньше на 1 мкмоль липида, можно удовлетворить условию, что количество частиц, имеющих размер частиц более 10 мкм, которые содержатся в фармацевтической композиции, составляет 6000 или меньше, а количество частиц, имеющих размер более 25 мкм, составляет 600 или меньше, что является стандартом, определенным в Методе Испытания Нерастворимых Частиц в Японской Фармакопее <6.07> Инъекции.

Также в липосомальной композиции в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, предпочтительно, чтобы количество частиц, имеющих размер частиц больше чем 10 мкм, было 150 или меньше, а количество частиц, имеющих размер частиц больше чем 25 мкм, было 15 или меньше на 1 мкмоль липида после хранения в течение 1 месяца при 5°C. Более предпочтительно, чтобы количество частиц, имеющих размер частиц больше чем 10 мкм, было 75 или меньше, а количество частиц, имеющих размер частиц больше чем 25 мкм, было 7,5 или меньше на 1 мкмоль липида после хранения в течение 1 месяца при 5°C. Еще более предпочтительно, чтобы количество частиц, имеющих размер частиц больше чем 10 мкм, было 25 или меньше, а количество частиц, имеющих размер частиц больше чем 25 мкм, было 2,5 или меньше на 1 мкмоль липида после хранения в течение 1 месяца при 5°C.

Кроме того, крупные частицы, имеющие размер более 10 мкм, часто увеличиваются из–за ухудшения со временем в процессе хранения, и предпочтительно удовлетворять вышеуказанному количеству частиц даже после хранения в течение 3 месяцев, и более предпочтительно удовлетворять вышеуказанному количеству частиц даже после хранения в течение 1 года.

[0023] “Субъект” представляет собой млекопитающее, такое как человек, мышь, обезьяна или домашнее животное, нуждающееся в профилактике или лечении заболевания или т.п., и предпочтительно представляет собой человека, нуждающегося в профилактике или лечении заболевания или т.п.

[0024] Далее настоящее изобретение будет описано подробно.

Липосомальная композиция в соответствии с первым вариантом осуществления настоящего изобретения представляет собой липосомальную композицию, включающую гидрофильный полимер–модифицированн диацилфосфатидилэтаноламин, дигидросфингомиелин и холестерины в качестве компонентов липосомальной мембраны, где липосомальная композиция инкапсулирует лекарственное средство, ее внутренняя водная фаза содержит сульфат аммония, и молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом составляет 0,36 или больше.

Кроме того, липосомальная композиция в соответствии со вторым вариантом осуществления настоящего изобретения представляет собой липосомальную композицию, включающую гидрофильный полимер–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин, дигидросфингомиелин и холестерины в качестве компонентов липосомальной мембраны, где липосомальная композиция инкапсулирует лекарственное средство, ее внутренняя водная фаза содержит сульфат аммония, и дигидросфингомиелин представляет собой дигидросфингомиелин, имеющий длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 16 атомов углерода, и длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 18 атомов углерода.

[0025] В настоящем изобретении удержание липосомы в крови улучшается путем использования гидрофильный полимер–модифицированного диацилфосфатидилэтаноламина, дигидросфингомиелина и холестеринов в качестве компонентов липосомальной мембраны. Кроме того, включение сульфата аммония во внутреннюю водную фазу подавляет утечку лекарственного средства из липосомы в крови и поэтому улучшает AUC. Кроме того, при установлении молярного отношения сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом, равного 0,36 или больше, утечка лекарственного средства из липосомы в крови еще больше подавляется, и поэтому достигается более высокое значение AUC.

[0026] Как результат вышеизложенного, просачивание лекарственного средства из внутренней водной фазы во внешнюю водную фазу может подавляться в процессе хранения на холоду, и образование нерастворимых частиц может подавляться даже в нейтральных условиях. Таким образом, в липосомальной композиции в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения pH внешней водной фазы может быть установлен близким к нейтральному (pH 7,4), и стало возможным использование “гидрофильный полимер–модифицированного диацилфосфатидилэтаноламина”, гидролизующегося в кислотных условиях, для улучшения удержания липосом в крови.

[0027] (Липосома)

Липосома представляет собой закрытое везикулярное тело, образованное липидной двухслойной мембраной с использованием липидов, и имеет водную фазу (внутреннюю водную фазу) в пространстве закрытой везикулы. Внутренняя водная фаза содержит воду и т.п. Липосомы обычно присутствуют в диспергированном состоянии в водном растворе (внешняя водная фаза) с наружной стороны закрытой везикулы. Липосома может иметь структуру из одного слоя (которая также называется однослойной, или представляет собой структуру, имеющую одну двухслойную мембрану) или многослойную структуру (которая также называется многослойной и представляет собой подобную луковицы структуру, имеющую несколько двухслойных мембран, где отдельные слои разделены водными слоями). В настоящем изобретении однослойная липосома является предпочтительной с точки зрения безопасности и стабильности в фармацевтических применениях.

[0028] Липосома конкретно не ограничивается в том, что касается ее формы, при условии, что она представляет собой липосому, способную инкапсулировать лекарственное средство. “Инкапсулирование” означает принятие формы, в которой лекарственное средство содержится во внутренней водной фазе и в самой мембране применительно к липосоме. Например, липосома может представлять собой форму, где лекарственное средство инкапсулировано в замкнутом пространстве, образованном мембраной, форму, где лекарственное средство инкапсулировано в самой мембране, или их комбинацию.

[0029] Средний размер частиц липосом, как правило, составляет от 10 нм до 1000 нм, предпочтительно от 20 нм до 500 нм, более предпочтительно от 30 до 300 нм, еще более предпочтительно от 30 нм до 200 нм, даже более предпочтительно 150 нм или меньше, например от 30 нм до 150 нм, и особенно предпочтительно от 70 до 150 нм.

Липосома предпочтительно имеет сферическую форму или близкую к этому морфологию.

[0030] Компоненты, которые составляют липидный бислой липосомы, выбраны из липидов. В качестве липидов можно использовать такие, которые могут растворяться в смешанном растворителе, состоящем из водорастворимого органического растворителя и сложноэфирного органического растворителя.

Липосома в настоящем изобретении содержит гидрофильный полимер–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин, дигидросфингомиелин и холестерины в качестве компонентов липосомальной мембраны.

[0031] Липосома представляет собой закрытое везикулярное тело, образованное из липидной двухслойной мембраны с использованием липидов, как описано выше, и, как правило, липиды в качестве основного материала для формирования липидной двухслойной мембраны включают фосфолипиды, имеющие две ацильные цепи, например, природные или синтетические фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин), фосфатидилглицерин, фосфатидная кислота, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит, сфингомиелин и кардиолипин, и их гидрогенизированные продукты (например, гидрогенизированный соевый фосфатидилхолина (HSPC)).

[0032] В настоящем изобретении дигидросфингомиелин, который представляет собой фосфолипид, имеющий две ацильные цепи, используется в качестве липида, который является основным материалом для формирования липидной двухслойной мембраны.

Используя дигидросфингомиелин, можно улучшить удержание липосом в крови.

С использованием дигидросфингомиелина в качестве основного материала липосомной мембраны можно улучшить свойства разделения липосомной мембраны, чтобы предотвратить утечку инкапсулированного лекарственного средства. Предполагается, что это связано с тем, что амидные связи дигидросфингомиелина обладают способностью образовывать сильные водородные связи и могут образовывать прочные и хорошо разделяемые мембраны путем сильного взаимодействия друг с другом. Кроме того, амидные связи дигидросфингомиелина сильно взаимодействуют с гидроксильными группами холестерина, используемыми одновременно в настоящем изобретении, в результате чего может быть сформирована мембрана, имеющая высокие свойства разделения. Эта функция не может достигаться при помощи обычно используемых липидов, таких как HSPC и лецитин, имеющих сложноэфирные связи.

Кроме того, поскольку полностью насыщенный дигидросфингомиелин имеет более высокую температуру плавления и более низкую подвижность сформированной мембраны по сравнению со сфингомиелином, имеющим амидные связи, но имеющим ненасыщенные связи в ацильной цепи, предполагается, что дигидросфингомиелин может образовывать мембрану с более высокими свойствами разделения по сравнению со сфингомиелином.

Дигидросфингомиелин обычно имеет две длинноцепочечные алкильные группы в молекуле, и примеры дигидросфингомиелина, имеющего две длинноцепочечные алкильные группы, включают дигидросфингомиелин, имеющий две длинноцепочечные алкильные группы, содержащие 16 атомов углерода, дигидросфингомиелин, имеющий длинноцепочечные алкильные группы, содержащие 16 атомов углерода, и длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 18 атомов углерода, и дигидросфингомиелин, имеющий длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 16 атомов углерода, и длинноцепочечную алкильную группу, содержащую от 20 до 24 атомов углерода.

В качестве дигидросфингомиелина предпочтительно использовать следующее соединение, имеющее длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 16 атомов углерода, и длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 18 атомов углерода, с точки зрения предотвращения утечки лекарственного средства из липосом. Это связано с тем, что температура плавления становится выше с увеличением числа атомов углерода, и поэтому может быть сформирована липосомная мембрана, обладающая высокими свойствами разделения.

[0033]

[0034] В качестве дигидросфингомиелина можно использовать, например, дигидросфингомиелин, полученный путем восстановления природного сфингомиелина общепринятым способом, или можно использовать дигидросфингомиелин, полученный синтетическим путем.

Как правило, поскольку большинство дигидросфингомиелинов, полученных из натуральных продуктов, таких как куриные яйца, как правило, имеют две длинноцепочечные алкильные группы, содержащие 16 атомов углерода, предпочтительно использовать дигидросфингомиелин, полученный путем химического синтеза, с той точки зрения, что дигидросфингомиелин имеющий длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 16 атомов углерода, и длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 18 атомов углерода, можно получить с высокой чистотой.

[0035] Процентное содержание дигидросфингомиелина в компонентах липосомальной мембраны (общее количество липидов, образующих липосому) предпочтительно составляет 30–80 моль%, более предпочтительно 40–70 моль%, и еще более предпочтительно 50–60 моль%.

[0036] Примеры гидрофильного полимера в гидрофильный полимер–модифицированном диацилфосфатидилэтаноламине включают полиэтиленгликоли, полиглицерины, полипропиленгликоли, поливиниловые спирты, чередующиеся coполимеры стирола–ангидрида малеиновой кислоты, поливинилпирролидоны и синтетические полиаминокислоты. Указанные выше гидрофильные полимеры можно использовать отдельно или в виде комбинации двух или более из них.

[0037] Из них, с точки зрения удержания композиции в крови, предпочтительными являются полиэтиленгликоли, полиглицерины и полипропиленгликоли, и более предпочтительны полиэтиленгликоль (PEG), полиглицерин (PG), полипропиленгликоль (PPG) и их производные.

[0038] Полиэтиленгликоль (PEG) и его производные еще более предпочтительны с точки зрения многофункциональности и удержания в крови.

Примеры производных полиэтиленгликоля (PEG) включают метоксиполиэтиленгликоли без какого–либо конкретного ограничения.

[0039] Молекулярная масса полиэтиленгликолей конкретно не ограничивается, но она составляет от 500 до 10000 дальтон, предпочтительно от 1000 до 7000 дальтон, и более предпочтительно от 2000 до 5,000 дальтон.

[0040] Количество атомов углерода в ацильной группе диацилфосфатидилэтаноламина предпочтительно составляет 16 или больше, например, предпочтительно 16 или больше и 30 или меньше, более предпочтительно 16 или больше и 24 или меньше, и еще более предпочтительно 20.

[0041] Примеры полиэтиленгликоль–модифицированного диацилфосфатидилэтаноламина включают 1,2–дистеароил–3–фосфатидилэтаноламин–полиэтиленгликоли, такие как 1,2–дистеароил–3–фосфатидилэтаноламин–PEG2000 (изготовитель Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), 1,2–дистеароил–3–фосфатидилэтаноламин–PEG5000 (изготовитель Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) и дистеароилглицерин–PEG2000 (изготовитель Nippon Oil & Fats Co., Ltd.).

[0042] Процентное содержание гидрофильный полимер–модифицированного диацилфосфатидилэтаноламина в компонентах липосомальной мембраны (общее количество липидов образующих липосом) предпочтительно составляет 1–15 моль%, и более предпочтительно 2–10 моль%.

[0043] Примеры холестеринов включают холестерин, который содержит циклопентагидрофенантрен в качестве основного скелета и в котором атомы углерода частично или полностью гидрированы, и его производные. Например, холестерин является предпочтительным. В случае, когда средний размер частиц липосомы уменьшается до 100 нм или менее, кривизна липидной мембраны увеличивается. Деформация мембраны, расположенной в липосоме, также становится больше. Эффективный результат дает добавление холестерина или т.п. для заполнения деформации мембраны, вызванной липидом (мембраностабилизирующий эффект).

[0044] Что касается липосомы, ожидается, что добавление холестерина уменьшит текучесть мембраны липосомы, например, путем заполнения промежутков в мембране липосомы.

[0045] Процентное содержание холестерина в компонентах липосомальной мембраны (липиды, образующие липосому) предпочтительно составляет от 20 моль% до 50 моль%, более предпочтительно от 30 моль% до 45 моль%, и еще более предпочтительно от 35 моль% до 43 моль%.

[0046] В дополнение к вышеперечисленным компонентам к липосоме можно добавить гидрофильный полимер или т.п. для улучшения удержания в крови, жирную кислоту, диацетилфосфат или т.п. в качестве стабилизатора структуры мембраны, или α–токоферол или т.п. в качестве антиоксиданта. В настоящем изобретении предпочтительно не использовать добавку, такую как диспергирующая добавка, которая не признана для медицинского применения, такого как внутривенные инъекции, например, поверхностно–активное вещество.

[0047] (Лекарственное средство)

Липосомальная композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения содержит лекарственное средство.

Тип лекарственного средства конкретно не ограничивается, но можно использовать противораковые средства, приведенные в качестве примера ниже. Конкретные примеры противоракового средства включают следующие:

противораковые средства на основе антрациклина, такие как доксорубицин, даунорубицин и эпирубицин;

противораковые средства на основе цисплатина, такие как цисплатин и оксалиплатин;

противораковые средства на основе таксана, такие как паклитаксел и доцетаксел;

противораковые средства на основе алкалоида барвинка, такие как винкристин и винбластин;

противораковые средства на основе блеомицина, такие как блеомицин;

противораковые средства на основе сиролимуса, такие как сиролимус;

противораковые средства на основе камптотецина, такие как топотекан (также называемый ногитеканом), иринотекан, каренитецин (зарегистрированная торговая марка) (также называемый BNP1350), экзатекан, луртотекан, гимекан (также называемый ST1481) и веротекан (также называемый как CKD602);

противораковые средства на основе алкалоида барвинка, такие как винкристин;

метаболические антагонисты, такие как метотрексат, фторурацил, гемцитабин, цитарабин и пеметрексед; а также

молекулярно–таргетные лекарственные средства, такие как иматиниб (Gleevec (зарегистрированная торговая марка)), эверолимус (Afinitol®), эрлотиниб (Tarceva (зарегистрированная торговая марка)), гефитиниб (Iressa (зарегистрированная торговая марка)), сунитиниб (Sutent (зарегистрированная торговая марка)), сорафениб (Nexavar (зарегистрированная торговая марка)), дасатиниб (Splicel (зарегистрированная торговая марка)), тамиваротен (Amnolake (зарегистрированная торговая марка)), третиноин (Besanoid (зарегистрированная торговая марка)), бортезомиб (Velcade (зарегистрированная торговая марка)) и лапатиниб (Tykerb (зарегистрированная торговая марка)).

Среди вышеуказанных лекарственных средств предпочтительными являются топотекан (также называемый ногитеканом), доксорубицин, иринотекан или сунитиниб, и более предпочтительным является топотекан.

[0048] Лекарственное средство можно использовать в форме соли.

Примеры соли лекарственного средства включают соли в основной группе, такой как аминогруппа, гидроксильной группе и кислотной группе, такой как карбоксильная группа, которые обычно известны в данной области.

[0049] Примеры соли в основной группе включают соли с минеральными кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота, борная кислота, азотная кислота и серная кислота; соли с органическими карбоновыми кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, молочная кислота, лимонная кислота, щавелевая кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, винная кислота, аспарагиновая кислота, трихлоруксусная кислота и трифторуксусная кислота; и соли с сульфоновыми кислотами, такими как метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п–толуолсульфоновая кислота, мезитиленсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота.

[0050] Примеры соли в кислотной группе включают соли с щелочными металлами, такими как натрий и калий; соли с щелочноземельными металлами, такими как кальций и магний; соли аммония; и соли с азот–содержащими органическими основаниями, такими как триметиламин, триэтиламин, трибутиламин, пиридин, N,N–диметиланилин, N–метилпиперидин, N–метилморфолин, диэтиламин, дициклогексиламин, прокаин, дибензиламин, N–бензил–β–фенетиламин, 1–эфенамин и N,N'–дибензилэтилендиамин.

[0051] Содержание лекарственного средства в липосомальной композиции конкретно не ограничивается, но предпочтительно составляет 0,025–20 мг/мл и более предпочтительно 0,25–10 мг/мл липосомальной композиции.

[0052] Количество инкапсулированного в липосоме лекарственного средства по отношению к образующему липосомальную мембрану липиду находится в пределах молярных отношений предпочтительно 0,1–1,5, более предпочтительно 0,2–0,3, с точки зрения скорости высвобождения из липосомы, осмотического давления внутри липосомы и формы липосомы, зависящей от осажденного лекарственного средства.

[0053] В случае, когда молярное отношение количества лекарственного средства к липиду слишком мало, площадь липосомной мембраны относительно единичной дозы лекарственного средства увеличивается, скорость высвобождения лекарственного средства из липосомы увеличивается, и поэтому функция улучшения удержания в крови нарушается. С другой стороны, в случае, когда молярное отношение количества лекарственного средства к липиду слишком велико, осмотическое давление внутри липосомы увеличивается с увеличением количества растворенного лекарственного средства, что приводит к разрушению липосомы, или в случае, когда лекарственное средство осаждается внутри липосомы, осажденное твердое вещество становится большим, что приводит к деформации формы липосомы.

[0054] (Сульфат аммония во внутренней водной фазе)

Внутренняя водная фаза липосомы в настоящем изобретении содержит сульфат аммония. В липосомальной композиции, которая представляет собой первый вариант осуществления настоящего изобретения, молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом составляет 0,36 или больше, и предпочтительно 0,4 или больше. Молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом составляет более предпочтительно 0,4 или больше и 1,8 или меньше, еще более предпочтительно 0,6 или больше и 1,8 или меньше. Установив молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом, как описано выше, можно подавить утечку лекарственного средства из липосомы в крови. В случае, когда молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом слишком низкое, это приводит к неполному образованию твердой частицы лекарственного средства из–за сульфата, увеличению концентрации лекарственного средства в растворенном состоянии, что приводит к повышенной проницаемости липосомальной мембраны в липосоме и легкой утечке лекарственного средства из липосомы, таким образом, эффект улучшения удержания в крови снижается. Кроме того, в случае, когда молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом слишком велико, осмотическое давление внутри липосомы будет высоким, что приведет к разрушению структуры липосомы, поэтому лекарственное средство может вытекать из липосомы, и, таким образом, эффект улучшения удержания в крови снижается.

[0055] Кроме того, в настоящем изобретении процент сульфат–ионов, содержащихся во внутренней водной фазе липосомы, относительно сульфат–ионов в липосомальной композиции в целом (доля сульфат–ионов во внутренней водной фазе) предпочтительно составляет по меньшей мере 80% и более предпочтительно 90% или больше, и одновременно процент лекарственного средства, содержащегося во внутренней водной фазе липосомы, относительно лекарственного средства в липосомальной композиции в целом (доля лекарственного средства во внутренней водной фазе) предпочтительно составляет по меньшей мере 80% и более предпочтительно 90% или больше.

[0056] Концентрацию лекарственного средства в липосоме можно измерить, например, жидкостой хроматографией/детекцией поглощения в ультрафиолетовой и видимой области спектра. Кроме того, концентрацию сульфат–ионов во внутренней водной фазе липосомы можно измерить, например, методом ионной хроматографии.

[0057] (pH внешней водной фазы)

Липосомальная композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может включать липосому, инкапсулирующую лекарственное средство, и водный растворитель (внешняя водная фаза), в котором диспергирована липосома. Внешняя водная фаза предпочтительно имеет нейтральный pH и, в частности, pH около 5,5–8,5.

[0058] В случае, когда утечка лекарственного средства слишком сильно подавляется, вытекание лекарственного средства на пораженном участке, особенно в месте опухоли, также может подавляться, и, следовательно, желаемая эффективность может не достигаться.

Липосомальная композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения обладает удивительным механизмом подавления утечки лекарственного средства в крови, доставки достаточного количества лекарственного средства на участок опухоли и быстрого высвобождения лекарственного средства на участке опухоли.

[0059] Участок опухоли обладает таким свойством, что концентрация аммония в нем выше, чем в других органах, таких как кровь (цитируемая статья: Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 11 (2015) 1841–1850). Липосомальная композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения демонстрирует значительно большее высвобождение лекарственного средства в среде, в которой усиливается разложение глутамина и, следовательно, концентрация аммония высокая (5 ммоль/л), как в опухоли.

[0060] Липосомальная композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения имеет скорость высвобождения лекарственного средства 20%/24 часа или меньше при 37°C из липосом в плазме, имеющей концентрацию аммония 1 ммоль/л или меньше, и скорость высвобождения лекарственного средства 60% или более при 37°C из липосом в плазме, имеющей концентрацию аммония 4–6 ммоль/л; и более предпочтительно скорость высвобождения лекарственного средства 15%/24 часа или меньше при 37°C из липосом в плазме, имеющей концентрацию аммония 1 ммоль/л или меньше, и скорость высвобождения лекарственного средства 70% или больше при 37°C из липосом в плазме, имеющей концентрацию аммония 4–6 ммоль/л.

[0061] (Способ получения липосомальной композиции)

Способ получения липосомальной композиции в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения конкретно не ограничивается. Например, липосомальную композицию в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения можно получить с использованием следующих стадий:

(a) получение масляной фазы;

(b) получение водной фазы;

(c) образование липосомных частиц эмульгированием;

(d) регулирование размера частиц при помощи экструдера;

(e) замена жидкости внешней водной фазы липосомы путем диализа;

(f) инкапсулирование лекарственного средства в липосомные частицы методом дистационной загрузки; и

(g) удаление лекарственного средства из внешней водной фазы путем диализа.

Регулирование размера частиц при помощи экструдера (d) можно осуществлять, но это необязательно.

[0062] <(a) Получение масляной фазы>

(a) При получении масляной фазы отдельные компоненты (гидрофильный полимер–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин, дигидросфингомиелин и холестерины), составляющие липосому, и органический растворитель смешивают и смесь нагревают для растворения вышеуказанных компонентов, таким образом может быть получена масляная фаза.

Хотя органический растворитель, используемый в масляной фазе, конкретно не ограничивается, например, можно использовать водорастворимый органический растворитель, который необязательно смешивают с водой.

[0063] Примеры водорастворимого органического растворителя включают спирты, такие как метанол, этанол, н–пропанол, изопропанол, н–бутанол, изобутанол и трет–бутанол; гликоли, такие как глицерин, этиленгликоль и пропиленгликоль; и полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль. Из них предпочтительными являются спирты. Спирт предпочтительно представляет собой, по меньшей мере один, выбранный из этанола, метанола, 2–пропанола или трет–бутанола, более предпочтительно, по меньшей мере один, выбранный из этанола, 2–пропанола или трет–бутанола, и еще более предпочтительным является этанол.

[0064] Концентрация каждого образующего липосому компонента конкретно не ограничивается и может быть подходящим образом отрегулирована.

[0065] <(b) Получение водной фазы>

Воду (дистиллированную воду, воду для инъекций или т.п.), физиологический солевой раствор, различные буферные растворы или водные растворы сахаров (сахарозы или т.п.) или их смеси (водный растворитель) можно использовать в качестве водной фазы. В настоящем изобретении предпочтительно использовать водный раствор сульфата аммония в качестве водной фазы в случае, когда лекарственное средство инкапсулируют в липосомные частицы методом дистационной загрузки, который будет описан ниже.

[0066] Буферный раствор не ограничивается органическими и неорганическими буферными растворами, и подходящим образом используют буферный раствор, обладающий буферным действием в диапазоне рН, близком к рН жидкости организма, и его примеры включают фосфатный буферный раствор, трис–буферный раствор, цитратный буферный раствор, ацетатный буферный раствор и буферный раствор Гуда. Внутренняя водная фаза липосомы может представлять собой водный раствор, в котором диспергируют липосомы в случае получения липосом, или может представлять собой свежедобавляемые воду, физиологический раствор, водный раствор различных буферных растворов или сахаров, или их смесь. Вода, используемая в качестве внешней водной фазы или внутренней водной фазы, предпочтительно не содержит примесей (пыли, химикатов или т.п.).

[0067] Физиологический солевой раствор относится к неорганическому солевому раствору, отрегулированному так, чтобы он был изотоническим с жидкостями человеческого организма, и может дополнительно иметь буферную функцию. Примеры физиологического солевого раствора включают физиологический раствор, содержащий 0,9% масс/об (массовый/объемный процент) хлорида натрия, PBS и Tris забуференный физиологический солевой раствор.

[0068] В настоящем изобретении водная фаза включает как внешнюю водную фазу, так и внутреннюю водную фазу.

Внешняя водная фаза в настоящем изобретении означает водный раствор, в котором диспергированы липосомы. Например, в случае инъекции раствор, занимающий пространство снаружи липосомы в жидкой дисперсии липосом, упакованной и хранящейся во флаконе или предварительно заполненном шприце, становится внешней водной фазой. Также, аналогично этому для жидкости, которая должна быть диспергирована во время использования, в случае введения с использованием прилагаемого диспергирующего раствора или других растворов, раствор, занимающий пространство вне липосомы в жидкой дисперсии липосом, становится внешней водной фазой.

Внутренняя водная фаза в настоящем изобретении относится к водной фазе в закрытых везикулах, разделенной липидными бислойными мембранами липосом.

[0069] <(с) Образование липосомных частиц путем эмульгирования>

На стадии эмульгирования масляную фазу и водную фазу смешивают с получением водного раствора, содержащего липиды, которые затем могут быть эмульгированы при перемешивании. Масляную фазу, в которой липид растворен в органическом растворителе, и водную фазу смешивают, перемешивают и эмульгируют с получением таким образом эмульсии, в которой масляная фаза и водная фаза эмульгированы по типу масло/вода (масло–в–воде). После смешивания образуются липосомы при удалении части или всего органического растворителя из масляной фазы путем выпаривания. Альтернативно, часть или весь органический растворитель в масляной фазе испаряется в ходе перемешивания–эмульгирования с образованием липосом.

[0070] В качестве метода перемешивания для уменьшения размера частиц используют ультразвуковые волны или механическое усилие сдвига. Кроме того, для обеспечения однородности размеров частиц можно осуществить обработку в экструдере или обработку в микрофлюидизаторе, предусматривающую пропускание через фильтр с определенным размером пор. Использование экструдера или т.п. может привести к разложению вторично образованных мультивезикулярных липосом в унивезикулярные липосомы.

[0071] Стадия эмульгирования не ограничивается при условии, что она является стадией эмульгирования, но предпочтительно она представляет собой стадию применения высокого усилия сдвига и осуществления микроизмельчения частиц со стадией эмульгирования, включающей органический растворитель. Высокая скорость сдвига определяется как линейная скорость вращения перемешивающей лопасти эмульгирующей машины и предпочтительно составляет от 5 м/сек до 32 м/сек, и особенно предпочтительно от 20 м/сек до 30 м/сек. При необходимости можно осуществить выпаривание (десольватацию) органического растворителя, используемого на стадии эмульгирования, с образованием липосом.

[0072] Температура жидкости на стадии эмульгирования в случае получения липосом может быть соответствующим образом отрегулирована, но температура жидкости во время смешивания масляной фазы и водной фазы предпочтительно выше или равна температуре фазового перехода липида, который будет использоваться. Например, в случае, когда используют липид, имеющий температуру фазового перехода от 35 до 40°С, температуру жидкости предпочтительно устанавливают в диапазоне от 35 до 70°С.

[0073] На стадии эмульгирования органический растворитель и воду можно выпарить из водного раствора, содержащего липосомы. Что касается указанного выше выпаривания, часть или весь органический растворитель из масляной фазы и воду из водной фазы можно принудительно удалить в качестве стадии выпаривания, или часть или весь органический растворитель из масляной фазы и вода из водной фазы могут естественным образом испаряться в ходе перемешивания–эмульгирования.

[0074] Способ выпаривания конкретно не ограничивается. Например, можно осуществить по меньшей мере одну из стадии нагревания для выпаривания органического растворителя и воды, стадии продолжения выстаивания или медленного перемешивания после эмульгирования или стадии осуществления вакуумной дегазации.

[0075] <(d) Регулирование размера частиц с использованием экструдера>

Полученные липосомы можно сделать однородными по размеру частиц с использованием диализа, фильтрации, экструзионной обработки или т.п.

Экструзионная обработка означает стадию пропускания липосом через фильтр, имеющий мелкую пору, для приложения физической силы сдвига, таким образом, осуществляя измельчение липосом на микрочастицы. В случае, когда липосомы пропускают через фильтр, их быстрое измельчение до микрочастиц может быть достигнуто путем инкубации жидкой дисперсии липосом и фильтра при температуре выше или равной температуре фазового перехода мембраны, составляющей липосому.

Кроме того, регулирование размера частиц с помощью экструдера можно осуществлять или не осуществлять.

[0076] <(е) Замена жидкости внешней водной фазы липосомы путем диализа>

В настоящем изобретении в случае, когда лекарственное средство инкапсулируют в липосомные частицы путем дистационной загрузки, жидкость внешней водной фазы липосомы может быть заменена путем диализа. Водный раствор 0,05–5% масс. NaCl можно использовать в качестве диализной жидкости, которая конкретно не ограничивается. Диализ липосомной жидкости с использованием вышеуказанной диализной жидкости может обеспечить липосомы, в которых сульфат аммония, присутствующий во внешней водной фазе, удаляется, а внешняя водная фаза заменяется диализной жидкостью.

[0077] <(f) Инкапсулирование лекарственного средства в липосомные частицы способом дистационной загрузки>

В настоящем изобретении предпочтительно инкапсулировать лекарственное средство в липосомные частицы способом дистационной загрузки.

[0078] В настоящем изобретении способ дистационной загрузки относится к способу, включающему получение пустых липосом, в которые не включено лекарственное средство, с последующим добавлением лекарственного средства во внешнюю жидкость липосом для включения лекарственного средства в липосомы. Способ дистационной загрузки конкретно не ограничивается, но способ с использованием аммониевой соли является предпочтительным, и более предпочтительным является способ с использованием сульфата аммония.

[0079] В способе дистанционной загрузки лекарственное средство, добавляемое во внешнюю жидкость, активно переносится в липосомы и включается в липосомы. В качестве движущей силы используют градиент растворимости, ионный градиент, градиент рН или т.п. Например, существует способ введения лекарственного средства в липосомы с использованием ионного градиента, образованного через липосомную мембрану. Например, существует методика добавления лекарственного средства в липосомы, которые предварительно сформированы, методом дистанционной загрузки с использованием градиента концентрации Na⁺/K⁺.

[0080] Из ионных градиентов обычно используют градиент концентрации протонов. Например, существует аспект, в котором внутренний (внутренняя водная фаза) рН липосомной мембраны имеет рН градиент ниже, чем внешний (внешняя водная фаза) рН. Градиент рН может быть, в частности, образован градиентом концентрации ионов аммония или т.п.

[0081] <(g) Удаление присутствующего во внешней водной фазе лекарственного средства путем диализа>

Содержащую липосомы с инкапсулированным лекарственным средством жидкость можно подвергнуть диализу для удаления лекарственного средства, не содержащегося в липосомах. Например, подвергая содержащую липосомы с инкапсулированным лекарственным средством жидкость диализу, используя предопределенную концентрацию сахарозного/гистидинового буфера в качестве диализной жидкости, лекарственное средство, присутствующее во внешней водной фазе, может быть удалено с получением липосомальной композиции, в которой внешняя водная фаза заменена диализной жидкостью.

[0082] <Стерилизующее фильтрование>

Липосомальную композицию, полученную выше, предпочтительно подвергают стерилизующей фильтрации. Что касается способа фильтрации, то можно удалить нежелательные материалы из водного раствора, содержащего липосомы, с использованием половолоконной мембраны, мембраны обратного осмоса, мембранного фильтра или т.п. В настоящем изобретении предпочтительно фильтровать липосомальную композицию через фильтр, имеющий стерилизуемый размер пор (предпочтительно фильтрующий стерилизующий фильтр 0,2 мкм).

[0083] Для предотвращения эффекта деформации липосом при среднем размере частиц стадию стерилизующей фильтрации и описанную ниже стадию асептического наполнения предпочтительно осуществляют при температуре ниже или равной температуре фазового перехода липида, составляющего липосомы. Например, в случае, когда температура фазового перехода липида составляет около 50°С, стадию стерилизующей фильтрации и описанную ниже стадию асептического наполнения осуществляют при температуре предпочтительно от около 0°С до 40°С, и более конкретно от около 5°С до 30°С.

[0084] [Асептическое наполнение>

Липосомальная композиция, полученная после стерилизующей фильтрации, предпочтительно используют для асептического наполнения для медицинских применений. Для асептического наполнения можно применять известные способы. Липосомальная композиция, подходящая для медицинского применения, может быть получена путем асептического наполнения контейнера липосомальной композицией.

[0085] (Фармацевтическая композиция)

В связи со способом введения, липосомальная композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может также содержать, по меньшей мере одно вещество из регулятора тоничности, стабилизатора, антиоксиданта или агента, регулирующего рН, которое является фармацевтически приемлемым. То есть липосомальная композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может быть предоставлена в виде фармацевтической композиции.

[0086] Регулятор тоничности конкретно не ограничивается, и его примеры включают неорганические соли, такие как хлорид натрия, хлорид калия, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия и дигидрофосфат калия; полиолы, такие как глицерин, маннит и сорбит; и сахара, такие как глюкоза, фруктоза, лактоза и сахароза.

[0087] Стабилизатор конкретно не ограничивается, и его примеры включают сахара, такие как глицерин, маннит, сорбит, лактоза и сахароза.

[0088] Антиоксидант конкретно не ограничивается, и его примеры включают аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, гомологи токоферола (например, витамин Е, четыре изомера токоферола α, β, γ и δ), цистеин и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Стабилизаторы и антиоксиданты могут соответственно использоваться отдельно или в комбинации двух или более из них.

[0089] Примеры агента, регулирующего рН, включают гидроксид натрия, лимонную кислоту, уксусную кислоту, триэтаноламин, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия и дигидрофосфат калия.

[0090] Липосомальная композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может содержать органический растворитель, коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, карбоксивиниловый полимер, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, полиакрилат натрия, альгинат натрия, водорастворимый декстран, натрий карбоксиметилкрахмал, пектин, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, ксантановую камедь, аравийскую камедь, казеин, желатин, агар, диглицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, вазелин, парафин, стеариловый спирт, стеариновую кислоту, человеческий сывороточный альбумин (HSA), маннит, сорбит, лактозу, фосфатно–солевой буферный раствор (PBS), хлорид натрия, сахара, биоразлагаемый полимер, бессывороточную среду, каждое из этих веществ является фармацевтически приемлемым, или добавку, которая является приемлемой в качестве фармацевтической добавки.

[0091] Контейнер, который заполняется липосомальной композицией в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, конкретно не ограничивается, и он предпочтительно выполнен из материала, имеющего низкую кислородопроницаемость. Примеры контейнера включают пластиковый контейнер, стеклянный контейнер и мешок из ламинированной пленки, содержащей алюминиевую фольгу, пленку, пленку с напылением алюминия, пленку с напылением оксида алюминия, пленку с напылением оксида кремния, поливиниловый спирт, сополимер этилена–винилового спирта, полиэтилентерефталат, полиэтиленнафталат, поливинилиденхлорид или т.п. в качестве газобарьерного слоя. Если необходимо, свет можно экранировать, используя цветное стекло, алюминиевую фольгу, пленку с напылением алюминия или т.п.

[0092] В контейнере, в котором находится липосомальная композиция, для предотвращения окисления кислородом, присутствующим в пространстве контейнера, предпочтительно заменять газы в пространстве контейнера и растворе лекарственного средства инертными газами, такими как азот. Например, раствор для инъекций барботируют азотом, таким образом, заполнение контейнера инъекционным раствором можно осуществить в атмосфере азота.

[0093] Способ введения фармацевтической композиции в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения предпочтительно представляет собой парентеральное введение. Примеры парентерального введения включают внутривенную инъекцию, такую как внутривенное закапывание, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, подкожную инъекцию, внутриглазную инъекцию и интратекальную инъекцию. Способ введения фармацевтической композиции может представлять собой, например, введение через шприц или внутривенное капельное введение.

[0094] Дозировка и частота введения фармацевтической композиции в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения могут быть соответствующим образом установлены в зависимости от типа лекарственного средства, состояния пациента и т.п. Доза фармацевтической композиции обычно может быть установлена в диапазоне от 0,01 мг/кг/день до 100 мг/кг/день в расчете на количество лекарственного средства, которое является активным ингредиентом. Доза фармацевтической композиции может быть установлена в диапазоне от 2 до 10 мг на дозу в расчете на массу лекарственного средства, которое является активным ингредиентом, но не ограничивается этими дозами.

[0095] Фармацевтическую композицию в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения предпочтительно можно использовать в качестве противоракового средства.

Тип рака, для которого применяется фармацевтическая композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, конкретно не ограничивается, и его примеры включают рак легкого (особенно мелкоклеточный рак легкого), рак яичника, солидную опухоль у детей, рак шейки матки, рак молочной железы рак, рак предстательной железы, рак эндометрия, рак желудка (аденокарцинома желудка), немелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы, плоскоклеточный рак шейки матки, рак пищевода, рак мочевого пузыря, меланому, рак толстой кишки, рак почки, неходжкинскую лимфому, уротелиальный рак, множественную миелому, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, Т–клеточный лейкоз у взрослых, метастатический рак костного мозга, саркому, опухоль мягких тканей, хронический миеломоноцитарный лейкоз, лимфому Ходжкина и кожную Т–клеточную лимфому.

Примеры

[0096]

Далее настоящее изобретение будет описано подробно со ссылкой на Примеры. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими Примерами.

SM представляет собой сфингомиелин (COATSOME NM–10, изготовитель NOF Corporation).

DHSM, полученный из куриного яйца, представляет собой дигидросфингомиелин, полученный гидрированием SM, происходящего из куриного яйца (синтетический продукт, полученный гидрированием COATSOME NM–10 (изготовитель NOF Corporation)). Этот DHSM, происходящий из куриного яйца, представляет собой смесь, содержащую DHSM, имеющий две алкильные цепи, содержащие 16 атомов углерода, что составляет от 70 до 80% от общего количества DHSM, происходящего из куриного яйца, и DHSM, имеющий различные длины алкильных цепей, который составляет остальное количество.

Полностью синтетический DHSM представляет собой дигидросфингомиелин, полученный химическим синтезом так, чтобы он содержал 98% или более следующего соединения, имеющего длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 16 атомов углерода, и длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 18 атомов углерода.

[0097]

[0098] SUNBRIGHT DSPE–020CN (далее указан как DSPE–PEG, изготовитель NOF Corporation) использовали в качестве PEG фосфолипида (в таблице указан как PEG).

Холестерин HP (изготовитель Nippon Fine Chemical Co., Ltd.) использовали в качестве холестерина (в таблице указан как Chol).

[0099] <Сравнительные примеры 1–10>

(a) Получение масляной фазы

Для Сравнительного примера 1 отвешивали соответственно 11,52 г SM, 4,32 г PEG фосфолипида и 4,32 г холестерина. Для Сравнительных примеров 2–10 количества SM или выделенного из куриного яйца DHSM, PEG фосфолипида и холестерина заменяли соотношениями, описанными в Таблице 1. Липид смешивали с 381 мл этанола и растворяли при 65°C с получением масляной фазы.

[0100] (b1) Получение водной фазы 1

25,2 г сульфата аммония растворяли в 1118,5 г воды с получением водной фазы 1.

(b2) Получение водной фазы 2

5,04 г сульфата аммония растворяли в 223,7 г воды с получением водной фазы 2.

[0101] (c) Образование липосомных частиц эмульгированием

Водную фазу 1, полученную в (b1), нагревали до 65°C, к ней добавляли всю масляную фазу, полученную в (a), и затем эти фазы смешивали с использованием прецизионного диспергатора–эмульгатора при линейной скорости вращения 26 м/сек в течение 60 минут. Затем добавляли водную фазу 2 при комнатной температуре, продолжая перемешивание при линейной скорости вращения 0,1 м/сек при нагревании при 65°C для выпаривания органического растворителя и воды. В случае концентрирования жидкости до 600 мл нагревание и перемешивание прекращали, и поэтому прекращалось испарение.

[0102] (e) Замена жидкости внешней водной фазы липосомы путем диализа

Водный раствор 3,15% масс. NaCl использовали в качестве диализной жидкости. С использованием этой диализной жидкости жидкость, полученную в (c) подвергали фильтрации в перекрестном потоке при комнатной температуре для удаления сульфата аммония, присутствующего во внешней водной фазе, с получением липосом, в которых внешняя водная фаза заменена диализной жидкостью.

[0103] (f) Инкапсулирование топотекана в липосомные частицы методом дистационной загрузки

Воду для инъекций добавляли к топотекану гидрохлориду (изготовитель Biocompounds Pharmaceutical Inc.) до 5 мг/мл. Затем, тщательно перемешивая жидкость, добавляли 8 моль/л раствора HCl для доведения pH до около 3 для растворения топотекана. К полученному раствору топотекана добавляли липосомы при объемном соотношении 1/1, с последующим нагреванием при 60°C в течение 60 минут.

[0104] (g) Удаление топотекана из внешней водной фазы путем диализа

Получали сахарозный/гистидиновый буфер, состоящий из 9,4% масс. сахарозы и 10 ммоль/л гистидина, в качестве диализной жидкости. С использованием этой диализной жидкости жидкость, полученную в (f), подвергали фильтрации в перекрестном потоке при комнатной температуре для удаления топотекана, присутствующего во внешней водной фазе, с получением топотекан–содержащих липосом, в которых внешняя водная фаза заменена диализной жидкостью.

[0105] Сравнительные Примеры 11 и 12

(a) Получение масляной фазы

Для Сравнительного примера 11 отвешивали соответственно 0,517 г выделенного из куриного яйца DHSM и 0,233 г холестерина. Для Сравнительного примера 12 количества SM и холестерина изменяли, используя отношения, описанные в Таблице 1. Для мечения липосом DiI (1,1’–диоктадецил–3,3,3’,3’–тетраметилиндокарбоцианин перхлоратом) количество DiI, которое составляло 0,2 моль% по отношению к общему количеству липидов, отвешивали и растворяли в этаноле. К этанольному раствору DiI добавляли этанол для получения общего объема 1,5 мл. Отвешанный липид и этот органический растворитель смешивали и нагревали до 65°C для растворения липида, получая таким образом масляную фазу.

[0106] (b) Получение водной фазы

0,9 г сульфата аммония и 2,16 г сахарозы растворяли в 13,5 г воды с получением водной фазы.

[0107] (c) Образование липосомных частиц путем смешивания масляной фазы и водной фазы

Водную фазу, полученную в (b), нагревали до 65°C и перемешивали при помощи магнитной мешалки (3000 об/мин). Всю масляную фазу, полученную в (a), нагревали до 65°C с использованием горячей пластины, и всю масляную фазу отсасывали шприцем и нагревали в течение 5 минут с использованием горячей пластины. Масляную фазу добавляли по каплям в течение 30 секунд к нагретой водной фазе.

[0108] (d) Регулирование размера частиц при помощи экструдера

Жидкость, полученную в (c), подвергали регулированию размера частиц, последовательно пропуская ее через фильтр с использованием экструдера (Mini Extruder, изготовитель Avanti Polar Lipids, Inc.) при нагревании при 70°C.

[0109] (e) Замена жидкости внешней водной фазы липосомы путем диализа

Водный раствор 0,09% масс. NaCl использовали в качестве диализной жидкости. С использованием этой диализной жидкости жидкость, полученную в (c) или (d), подвергали диализу при комнатной температуре для удаления сульфата аммония, присутствующего во внешней водной фазе, с получением липосом, в которых внешняя водная фаза заменена диализной жидкостью.

[0110] (f) Инкапсулирование топотекана в липосомные частицы методом дистационной загрузки

Воду для инъекций добавляли к топотекану гидрохлориду (изготовитель Biocompounds Pharmaceutical Inc.) до 5 мг/мл. Затем, тщательно перемешивая жидкость, добавляли 8 моль/л раствора HCl для доведения pH до около 3 для растворения топотекана. К полученному раствору топотекана добавляли липосомы при объемном соотношении 1/1, с последующим нагреванием при 60°C в течение 120 минут.

[0111] (g) Удаление топотекана из внешней водной фазы путем диализа

Получали сахарозный/гистидиновый буфер, состоящий из 9,4% масс. сахарозы и 10 ммоль/л гистидина, в качестве диализной жидкости. С использованием этой диализной жидкости жидкость, полученную в (f), подвергали диализу при комнатной температуре для удаления топотекана, присутствующего во внешней водной фазе, с получением топотекан–содержащих липосом, в которых внешняя водная фаза заменена диализной жидкостью.

[0112] <Примеры 1–8>

(a) Получение масляной фазы

Для Примера 1 отвешивали соответственно 11,52 г выделенного из куриного яйца DHSM, 4,32 г PEG фосфолипида (SUNBRIGHT DSPE–020CN, изготовитель NOF Corporation, далее указан как DSPE–PEG) и 4,32 г холестерина. Для Примеров 2–8 количества DHSM, DSPE–PEG и холестерина изменяли, используя отношения, описанные в Таблице 2. Липид смешивали с 381 мл этанола и растворяли при 65°C с получением масляной фазы.

[0113] (b1) Получение водной фазы 1

25,2 г сульфата аммония растворяли в 1118,5 г воды с получением водной фазы 1.

(b2) Получение водной фазы 2

5,04 г сульфата аммония растворяли в 223,7 г воды с получением водной фазы 2.

[0114] (c) Образование липосомных частиц путем эмульгирования

Водную фазу 1, полученную в (b1), нагревали до 65°C, к ней добавляли всю масляную фазу, полученную в (a), и затем эти фазы смешивали с использованием прецизионного диспергатора–эмульгатора при линейной скорости вращения 26 м/сек в течение 60 минут. Затем добавляли водную фазу 2 при комнатной температуре, с последующим непрерывным перемешиванием при линейной скорости вращения 0,1 м/сек при нагревании при 65°C для выпаривания органического растворителя и воды. Нагревание и перемешивание прекращали в случае концентрирования жидкости до 600 мл, и поэтому испарение прекращалось.

[0115] (e) Замена жидкости внешней водной фазы липосомы путем диализа

Водный раствор 3,15% масс. NaCl использовали в качестве диализной жидкости. С использованием этой диализной жидкости жидкость, полученную в (c), подвергали фильтрации в перекрестном потоке при комнатной температуре для удаления сульфата аммония, присутствующего во внешней водной фазе, с получением липосом, в которых внешняя водная фаза заменена диализной жидкостью.

[0116] (f) Инкапсулирование топотекана в липосомные частицы методом дистационной загрузки

Воду для инъекций добавляли к топотекану гидрохлориду (изготовитель Biocompounds Pharmaceutical Inc.) до 5 мг/мл. Затем, тщательно перемешивая жидкость, добавляли 8 моль/л раствора HCl для доведения pH до около 3 для растворения топотекана. К полученному раствору топотекана добавляли липосомы при объемном соотношении 1/1, с последующим нагреванием при 60°C в течение 60 минут.

[0117] (g) Удаление топотекана из внешней водной фазы путем диализа

Получали сахарозный/гистидиновый буфер, состоящий из 9,4% масс. сахарозы и 10 ммоль/л гистидина, в качестве диализной жидкости. С использованием этой диализной жидкости жидкость, полученную в (f), подвергали фильтрации в перекрестном потоке при комнатной температуре для удаления топотекана, присутствующего во внешней водной фазе, с получением топотекан–содержащих липосом, в которых внешняя водная фаза заменена диализной жидкостью.

[0118] <Примеры 9 и 10>

(a) Получение масляной фазы

Для Примера 9 отвешивали соответственно 0,412 г выделенного из куриного яйца DHSM, 0,153 г DSPE–PEG и 0,153 г холестерина. Для Примера 10 количества выделенного из куриного яйца DHSM, DSPE–PEG и холестерина изменяли, используя отношения, описанные в Таблице 2. Для мечения липосом при помощи DiI количество DiI, которое составляло 0,2 моль% по отношению к общему количеству липидов, отмеривали и растворяли в этаноле. К полученному этанольному раствору DiI добавляли этанол для получения общего объема 11,25 мл и затем добавляли 3,75 мл этилацетата. Отвешанный липид и этот органический растворитель смешивали и нагревали до 60°C для растворения липида, получая таким образом масляную фазу.

[0119] (b) Получение водной фазы

0,9 г сульфата аммония растворяли в 40 г воды с получением водной фазы.

[0120] (c) Образование липосомных частиц путем эмульгирования

Водную фазу, полученную в (b), нагревали до 70°C, к ней добавляли всю масляную фазу, полученную в (a) (объемное соотношение: водная фаза/масляная фаза=8/3), и затем эти фазы смешивали с использованием эмульгирующей машины (гомогенизатор ED–3 Excel Auto, изготовитель Nippon Seiki Seisakusho Co., Ltd.) при 3000 об/мин (оборотов в минуту: 1/60сек^–1) в течение 30 минут. Затем смесь непрерывно перемешивали при 300 об/мин при нагревании при 65°C для выпаривания органического растворителя и воды. В случае концентрирования жидкости до 15 г, нагревание и перемешивание прекращали, и поэтому испарение прекращалось.

[0121] (d) Регулирование размера частиц при помощи экструдера

Жидкость, полученную в (c), подвергали регулированию размера частиц, последовательно пропуская ее через фильтр, с использованием экструдера (Mini Extruder, изготовитель Avanti Polar Lipids, Inc.) при нагревании при 70°C.

[0122] (e) Замена жидкости внешней водной фазы липосомы путем диализа

Водный раствор 0,09% масс. NaCl использовали в качестве диализной жидкости. С использованием этой диализной жидкости жидкость, полученную в (c) или (d), подвергали диализу при комнатной температуре для удаления сульфата аммония, присутствующего во внешней водной фазе, с получением липосом, в которых внешняя водная фаза заменена диализной жидкостью.

[0123] (f) Инкапсулирование топотекана в липосомные частицы методом дистационной загрузки

Воду для инъекций добавляли к топотекану гидрохлориду (изготовитель Biocompounds Pharmaceutical Inc.) до 5 мг/мл. Затем, тщательно перемешивая жидкость, добавляли 8 моль/л раствора HCl для доведения pH до около 3 для растворения топотекана. К полученному раствору топотекана добавляли липосомы при объемном соотношении 1/1, с последующим нагреванием при 60°C в течение 120 минут.

[0124] (g) Удаление топотекана из внешней водной фазы путем диализа

Получали сахарозный/гистидиновый буфер, состоящий из 9,4% масс. сахарозы и 10 ммоль/л гистидина, в качестве диализной жидкости. С использованием этой диализной жидкости жидкость, полученную в (f), подвергали диализу при комнатной температуре для удаления топотекана, присутствующего во внешней водной фазе, с получением топотекан–содержащих липосом, в которых внешняя водная фаза заменена диализной жидкостью.

[0125] [Измерение и оценка физических свойств]

<Средний размер частиц>

В настоящем изобретении средний размер частиц относится к кумулятивному среднему размеру частиц, измеренному методом динамического рассеяния света. Средний размер частиц в каждом из Примеров и Сравнительных примеров, описанных в таблице, представляет собой кумулятивный средний размер частиц, измеренный методом динамического рассеяния света с использованием анализатора размера частиц в концентрированной системе FPAR–1000AS (изготовитель Otsuka Electronics Co., Ltd.), с использованием автоматического пробоотборника.

Результаты измерений приведены в Таблицах 1 и 2.

[0126] <Измерение концентрации топотекана>

Образец измеряли высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на устройстве Nexera–i LC–2040C (изготовитель Shimadzu Corporation) для количественного определения концентрации топотекана. Результаты показаны в Таблицах 1 и 2. Конкретный метод измерения заключается в следующем.

В липосомах Таблиц 1 и 2 процент лекарственного средства, содержащегося во внутренней водной фазе липосомы, относительно лекарственного средства в липосомальной композиции в целом составлял по меньшей мере 95%, за исключением Сравнительного примера 10, в котором процент лекарственного средства, содержащегося во внутренней водной фазе липосомы, относительно лекарственного средства в липосомальной композиции в целом составлял 59%.

[0127] Измерение количества топотекана в липосомальной композиции

Полученную липосомальную жидкость растворяли в метаноле и фильтровали с получением раствора образца. Топотекан гидрохлорид разбавляли с получением стандартного раствора для калибровочной кривой. С использованием раствора образца и стандартного раствора для калибровочной кривой, полученных таким образом, количество топотекана в липосомальной композиции измеряли жидкостной хроматографией/детекцией поглощения в ультрафиолетовой и видимой области спектра.

Концентрацию топотекана во внутренней водной фазе рассчитывали путем вычитания концентрации топотекана во внешней водной фазе из концентрации топотекана в водной фазе в целом. Концентрацию топотекана в каждой водной фазе измеряли следующим образом.

(Концентрация топотекана в водной фазе в целом)

Отмеряли 50 мкл жидкой дисперсии липосом и добавляли 950 мкл метанола, с последующим перемешиванием вихревым способом в течение 1 минуты. Отмеряли 100 мкл жидкости и добавляли к ней 900 мкл Milli–Q воды, с последующим перемешиванием вихревым способом в течение 1 минуты, с получением образца для ВЭЖХ анализа.

(Концентрация топотекана во внешней водной фазе)

Отмеряли 50 мкл жидкой дисперсии липосом и затем разбавляли добавлением 450 мкл водного раствора 9,4% масс. сахарозы/10 мМ гистидина. 200 мкл PBS добавляли к 100 мкл разбавленной жидкости и затем смешивали путем переворачивания сосуда. Жидкую дисперсию подвергали ультрацентрифугированию (200000g, 20°C, 60 минут) и супернатант использовали в качестве образца для ВЭЖХ анализа. Ультрацентрифугирование осуществляли с использованием Hitachi himac CP80WX.

a) Получение стандартного раствора для калибровочной кривой

Отвешивали примерно 20 мг топотекана гидрохлорида и растворяли в 20 мл 10% масс. водного раствора метанола. К этой жидкости добавляли Milli–Q воду с получением раствора, имеющего концентрацию топотекана гидрохлорида 0,1, 1,0, 5,0, 10,0, 20,0, 50,0 или 100,0 ч/млн, который затем использовали в качестве стандартного раствора для калибровочной кривой.

b) Получение раствора образца

(1) Отмеряли примерно 50 мкл образца (раствор липосомальной композиции) при помощи MICROMAN (зарегистрированная торговая марка) и добавляли около 950 мкл метанола, который отмеряли при помощи MICROMAN. После встряхивания в течение примерно 1 минуты раствор, как было визуально подтверждено, становился прозрачным.

(2) 100 мкл раствора указанного выше (1) отмеряли при помощи MICROMAN и добавляли около 900 мкл Milli–Q воды, отмеренной при помощи микропипетки. Эту жидкость встряхивали в течение примерно 1 минуты, обрабатывали ультразвуком в течение примерно 1 минуты и снова встряхивали в течение примерно 10 секунд.

(3) Раствор, полученный фильтрованием раствора указанного выше (2) через DISMIC (зарегистрированная торговая марка) фильтр (диаметр пор: 0,45 мкм), использовали в качестве раствора образца.

c) Измерение

Измерение осуществляли жидкостной хроматографией/ детекцией поглощения в ультрафиолетовой и видимой области спектра в следующих условиях.

Длина волны: 382 нм, колонка: Shiseido CAPCELLPAK C18 ACR 3мкм_3,0мм×75мм

Температура колонки: постоянная температура около 40°C

Обе подвижные фазы A и B представляли собой смесь воды/метанола/трифторуксусной кислоты, и подачу подвижных фаз осуществляли путем изменения смешиваемого соотношения подвижных фаз A и B для контроля градиента концентрации.

Скорость потока: 1,0 мл/мин, объем вводимой пробы: 10 мкл, температура автоматического дозатора: постоянная температура около 25°C.

[0128] <Измерение концентрации сульфат–ионов>

Образец измеряли ионной хроматографией на устройстве 883 Basic IC plus (изготовитель Metrohm AG) для количественного определения концентрации сульфат–ионов. Результаты измерения молярного отношения сульфат–ионов к топотекану показаны в Таблицах 1 и 2. В липосомах Таблиц 1 и 2 процент сульфат–ионов, содержащихся во внутренней водной фазе липосомы, относительно сульфат–ионов в липосомальной композиции в целом составлял по меньшей мере 90%.

Концентрацию сульфат–ионов во внутренней водной фазе рассчитывали путем вычитания концентрации сульфат–ионов во внешней водной фазе из концентрации сульфат–ионов в водной фазе в целом.

Концентрацию сульфат–ионов в каждой водной фазе измеряли следующим образом.

(Концентрация сульфат–ионов в водной фазе в целом)

Отмеряли 50 мкл жидкой дисперсии липосом и добавляли 950 мкл метанола, с последующим смешиванием при обработке ультразвуком в течение 15 секунд. Отмеряли 90 мкл жидкости и добавляли 810 мкл воды для инъекций (изготовитель Hikari Pharmaceutical Co., Ltd.) с последующим смешиванием при обработке ультразвуком в течение 30 секунд. К полученному раствору добавляли 900 мкл этилацетата, затем сильно встряхивали для выделения липидов в этилацетатную фазу. Отмеряли подходящее количество жидкости водной фазы и использовали для анализа методом ионной хроматографии.

(Концентрация сульфат–ионов во внешней водной фазе)

Отмеряли 100 мкл жидкой дисперсии липосом и затем разбавляли добавлением 900 мкл 5% раствора глюкозы (изготовитель Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.). 450 мкл полученной жидкости обрабатывали ультрафильтрацией и фильтрат использовали в качестве образца для анализа методом ионной хроматографии.

Условия центрифугирования были следующими: 7400g, 5°C и 30 минут. Использовали центрифугу Hitachi himac CF15RXII.

[0129] <Измерение AUC>

У мышей, которым вводили полученные топотекан–содержащие липосомы (доза: 1 мг/кг в расчете на количество лекарственного средства), брали кровь через 0,25, 2, 6, и 24 часов после введения. Кровь центрифугировали при 800×g в течение 10 минут для выделения плазмы. Концентрацию топотекана определяли в собранной плазме с использованием жидкостной хроматографии/масс–спектрометрии/масс–спектрометрии (ЖХ/МС/МС). С использованием программы для фармакокинетического анализа WinNonlin (зарегистрированная торговая марка) (коммерчески доступна от Certara, L.P.) площадь под кривой концентрация в крови–время (AUC) до бесконечности после однократного введения рассчитывали из изменения концентрации топотекана, полученной таким образом. Единицей AUC является время×нг/мл (выраженная в таблице как ч×нг/мл). Кроме того, рассчитанное значение AUC липосомы, описанной в [AACR–EORTC International Conference, San Francisco, California, October 22–26, 2007, #C113 A Pharmacokinetics Study of a Novel Sphingomyelin/Cholesterol Liposomal Topotecan and Non–Liposomal Topotecan in Rats, William C. Zamboni et al.] составляет 68152 часов×нг/мл.

[0130]

[0131]

[0132] Как можно видеть из результатов в Таблицах 1 и 2, в Примерах 1–10 липосомальной композиции, включающей гидрофильный полимер–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин, дигидросфингомиелин и холестерин в качестве компонентов липосомальной мембраны, в которой внутренняя водная фаза содержит сульфат аммония и молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом составляет 0,36 или больше, было показано, что измеренное значение AUC составляет 200000 или больше, и поэтому может достигаеться высокое удержание в крови. С другой стороны, в Сравнительных примерах 1–8, в которых не использовали дигидросфингомиелин, Сравнительных примерах 9 и 10, в которых молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к лекарственному средству в водной фазе в целом составляет меньше чем 0,36, и Сравнительных примерах 11 и 12, в которых не использовали гидрофильный полимер–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин, было показано, что измеренное значение AUC составляет меньше чем 200000, что меньше, чем в Примерах 1–10.

[0133] <Испытание эффективности лекарственного средства с использованием мышиной модели подкожной трансплантации A549>

1×10⁷A549 клеток, клеточная линия рака легкого человека,подкожно трансплантировали в правый бок мышей Balb/c/nu/nu (самки возраста 6 недель). Начиная с дня 15 после трансплантации животным вводили топотекан–содержащие липосомы, полученные в Примере 10 (4 мг/кг и 2 мг/кг в расчете на количество лекарственного средства, два раза каждую неделю), и топотекан–содержащие липосомы, полученные в Сравнительном примере 12 (4 мг/кг и 2 мг/кг в расчете на количество лекарственного средства, два раза каждую неделю). Кроме того, животным вводили физиологический солевой раствор в качестве отрицательного контроля. Кроме того, животным вводили водный раствор топотекана (2 мг/кг в расчете на количество лекарственного средства) в качестве сравнительного контроля. Массу тела и объем опухоли у животных измеряли два раза в неделю после начала введения. Результаты измерения массы тела показаны на Фиг. 1 и 2, и результаты измерения объема опухоли показаны на Фиг. 3 и 4.

[0134] На основании результатов Фиг. 3 и 4 было показано, что топотекан–содержащая липосома, полученная в Примере 10, демонстрирует более высокую эффективность лекарственного средства по сравнению с раствором топотекана, полученным в Сравнительном примере 12, и эффект является дозозависимым.

[0135] <Примеры 11–16 и Сравнительные примеры 13–16>

Топотекан–содержащие липосомы получали таким же способом, как в Примере 1, за исключением того, что для Примеров 11–16 количества DHSM, DSPE–PEG и холестерина изменяли таким образом, чтобы добавляемое количество холестерина и добавляемое количество выделенного из куриного яйца DHSM при регулировании масляной фазы приводило к отношениям, описанным в Таблице 3. Например, для Примера 11, топотекан–содержащие липосомы получали таким же способом, как в Примере 1, за исключением того, что добавляемое количество холестерина и добавляемое количество выделенного из куриного яйца DHSM при регулировании масляной фазы изменяли, добавляя 3,6 г холестерина и 12,9 г выделенного из куриного яйца DHSM.

Для Сравнительных примеров 13–16 количества SM, DSPE–PEG и холестерина изменяли, используя отношения, описанные в Таблице 3.

Подобным образом, результаты измерения размеров частиц, концентрации топотекана в водной фазе в целом, концентрации сульфат–ионов во внутренней водной фазе и AUC показаны в Таблице 3. Кроме того, значение AUC для каждого количества холестерина показано на Фиг. 5.

В липосомах Таблицы 3 процент лекарственного средства, содержащегося во внутренней водной фазе липосомы, относительно лекарственного средства в липосомальной композиции в целом, составлял по меньшей мере 98%, за исключением Сравнительного примера 13, в котором процент лекарственного средства, содержащегося во внутренней водной фазе липосомы, относительно лекарственного средства в липосомальной композиции в целом составил 68%.

В липосомах Таблицы 3 процент сульфат–ионов, содержащихся во внутренней водной фазе липосомы, относительно сульфат–ионов в липосомальной композиции в целом составлял по меньшей мере 90%, за исключением Сравнительного примера 13, в котором процент сульфат–ионов, содержащихся во внутренней водной фазе липосомы, относительно сульфат–ионов в липосомальной композиции в целом составил 71%.

[0136]

[0137] Из результатов Примеров 11–16 и Сравнительных Примеров 1, 2, 4, 7 и 13–16 можно видеть, что настоящее изобретение достигает приемлемого значения AUC для липосом с выделенным из куриного яйца DHSM при более широких пределах процента загружаемого холестерина, чем в SM липосомах. Кроме того, что касается липосом с выделенным из куриного яйца DHSM по настоящему изобретению, можно видеть, что AUC имеет более приемлемое значение, в частности, в случае, когда процентное содержание холестерина находится в пределах 35–43 моль%.

[0138] <Примеры 17–24 и Сравнительные примеры 17–24>

<Получение жидкой дисперсии липосом>

Топотекан–содержащие липосомы получали таким же способом, как в Примере 1, за исключением того, что для Примеров 17–24 и Сравнительных примеров 17–24 добавляемое количество каждого липида при регулировании масляной фазы установлено, как показано в Таблице 4, лекарственное средство для инкапсулирования в липосомные частицы методом дистационной загрузки установлено, как показано в Таблице 4, и лекарственные средства, отличные от топотекана, инкапсулировали способом, описанным в разделе <Инкапсулирование каждого противоракового лекарственного средства в липосомные частицы методом дистационной загрузки>, описанным ниже. Кроме того, относительное содержание компонентов липидной композиции в каждом из Примеров 17–24 и Сравнительных примеров 17–24 показано в Таблице 5.

[0139]

[0140]

[0141] <Инкапсулирование каждого противоракового средства в липосомные частицы методом дистационной загрузки>

Инкапсулирование доксорубицина (Примеры 19 и 20 и Сравнительные примеры 19 и 20): Воду для инъекций добавляли к доксорубицину гидрохлориду (изготовитель Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) до 4 мг/мл. Затем, тщательно перемешивая жидкость, добавляли 8 моль/л раствора HCl для доведения pH до около 3 для растворения доксорубицина гидрохлорида. К полученному раствору доксорубицина добавляли липосомы при объемном соотношении 1/1 и затем жидкую дисперсию, доведенную до pH 7,0, нагревали при 62°C в течение 60 минут.

Инкапсулирование сунитиниба (Примеры 21 и 22 и Сравнительные примеры 21 и 22): Воду для инъекций добавляли к сунитинибу малату (изготовитель Toronto Research Chemicals Inc.) до 5 мг/мл. Затем, тщательно перемешивая жидкость, добавляли 8 моль/л раствора HCl для доведения pH до около 3 для растворения сунитиниба малата. К полученному раствору сунитиниба добавляли липосомы при объемном соотношении 1/1 с последующим нагреванием при 62°C в течение 60 минут.

[0142] Инкапсулирование иринотекана (Примеры 23 и 24 и Сравнительные примеры 23 и 24): Воду для инъекций добавляли к иринотекану гидрохлориду (изготовитель Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) до 4 мг/мл. Затем, тщательно перемешивая жидкость, добавляли 8 моль/л раствора HCl для доведения pH до около 3 для растворения иринотекана гидрохлорида. К полученному раствору иринотекана добавляли липосомы при объемном соотношении 1/1 с последующим нагреванием при 62°C в течение 60 минут.

AUC в Примерах 17–22 и Сравнительных примерах 17–22 измеряли таким же способом, как описано выше в представленных Примерах. Результаты показаны в Таблице 6.

[0143]

[0144] Из результатов Примеров 17–22 и Сравнительных примеров 17–22 видно, что даже в случае, когда использовали любое из лекарственных средств либо топотекан, либо сунитиниб, липосомы с использованием DHSM демонстрировали лучшее удержание в крови по сравнению с SM липосомами и HSPC липосомами. Кроме того, было обнаружено, что липосомы с использованием полностью синтетического DHSM с чистотой 98% или больше DHSM, имеющего алкильную цепь, содержащую 16 атомов углерода, и алкильную цепь, содержащую 18 атомов углерода, в качестве DHSM обладают способностью к улучшению удержания в крови по сравнению с липосомами, в которых используют выделенный из куриного яйца DHSM.

[0145] Размер частиц, концентрацию топотекана, концентрацию сульфат–ионов и степень высвобождения измеряли в Примерах 17–24 и Сравнительных примерах 17–18 и 21–24. Результаты показаны в Таблице 7. Размер частиц, концентрацию топотекана и концентрацию сульфат–ионов измеряли таким же способом, как описано выше в представленных Примерах.

В липосомах Таблицы 7 процент лекарственного средства, содержащегося во внутренней водной фазе липосом, относительно лекарственного средства в липосомальной композиции в целом составлял по меньшей мере 95%.

В липосомах Таблицы 7 процент сульфат–ионов, содержащихся во внутренней водной фазе липосомы, относительно сульфат–ионов в липосомальной композиции в целом составлял по меньшей мере 95%.

Липосомальную композицию разбавляли 20–кратно при каждой концентрации содержащего хлорид аммония PBS буфера и измеряли степень высвобождения после инкубации в течение 4 часов. Степень высвобождения определяется как процент концентрации API, вытекший во внешнюю водную фазу, деленный на начальную концентрацию API в водной фазе в целом.

[0146] Для каждой концентрации содержащего хлорид аммония PBS буфера,

в Примерах 17 и 18 и Сравнительных примерах 17 и 18 (оценка липосом с инкапсулированным топотеканом) использовали PBS буфер, в котором растворяли 4,8 ммоль/л хлорида аммония,

в Примерах 19 и 20 и Сравнительных примерах 19 и 20 (оценка липосом с инкапсулированным доксорубицином) использовали PBS буфер, в котором растворяли 200 ммоль/л хлорида аммония,

в Примерах 21 и 22 и Сравнительных примерах 21 и 22 (оценка липосом с инкапсулированным сунитинибом) использовали PBS буфер, в котором растворяли 100 ммоль/л хлорида аммония, и

в Примерах 23 и 24 и Сравнительных примерах 23 и 24 (оценка липосом с инкапсулированным иринотеканом) использовали PBS буфер, в котором растворяли 4,8 ммоль/л хлорида аммония.

[0147]

[0148] В соответствии с результатами Примеров 17–24 и Сравнительных примеров 17, 18 и 21–24, скорость высвобождения из липосом с использованием DHSM ниже, чем из SM липосом и HSPC липосом, независимо от используемого средства, на основании чего можно ожидать улучшения удержания в крови. Кроме того, в случае, когда DHSM представляет собой полностью синтетический DHSM, имеющий чистоту 98% или больше, с алкильной цепью, содержащей 16 атомов углерода, и алкильной цепью, содержащей 18 атомов углерода, скорость высвобождения существенно снижается в липосомах с инкапсулированным топотеканом, липосомах с инкапсулированным доксорубицином и липосомах с инкапсулированным иринотеканом, и поэтому использование такого полностью синтетического DHSM, как оказалось, является более предпочтительным для подавления утечки лекарственного средства в крови.

[0149] <Измерение нерастворимых частиц>

Для каждого из Примеров 2, 3 и 4 образцы после хранения в течение одного месяца при 5°C измеряли в погруженном счетчике частиц (HACH ULTRA), и измеряли количество частиц больше чем 10 мкм и количество частиц больше чем 25 мкм в расчете на флакон с композицией (2 мл) (далее, если не указано иное, частицы больше чем 10 мкм относятся к частицам, имеющим размер частиц больше чем 10 мкм, а частицы больше чем 25 мкм относятся к частицам, имеющим размер частиц больше чем 25 мкм). Концентрация липида в Примерах 2, 3 и 4 составила 23 ммоль/л, а количество частиц на 1 мкмоль липида для частиц больше чем 10 мкм составило 0,7 для Примера 2, 1,1 для Примера 3 и 0,3 для Примера 4. Кроме того, количество частиц на 1 мкмоль липида для частиц больше чем 25 мкм составило 0,09 для Примера 2, 0,5 для Примера 3 и 0 для Примера 4. Известно, что инкапсулированный в липосомах топотекан распадается на плохо растворимые димеры в случае вытекания и воздействия нейтральной среды, превращаясь, таким образом, в нерастворимые частицы. Удивительным результатом является то, что образование нерастворимых частиц также уменьшается, поскольку утечка чрезвычайно хорошо подавляется настоящим изобретением.

Для Сравнительного примера 8 нерастворимые частицы в 1 флаконе, содержащем композицию (2 мл), измеряли также в образце после хранения в течение одного месяца при 5°C. Рассчитанное как количество частиц на 1 мкмоль липида, количество частиц больше чем 10 мкм составило 251, таким образом, значительно превысив предел 150, а количество частиц больше чем 25 мкм составило 17, таким образом, значительно превысив предел 15.

[0150] <Зависимость аммониевых ионов от степени высвобождения>

Степень высвобождения рассчитывали как процент концентрации вытекшего лекарственного средства (концентрация лекарственного средства во внешней водной фазе) относительно концентрации лекарственного средства в водной фазе в целом. Для DHSM липосом с инкапсулированным топотеканом, полученных в Примере 17, и DHSM липосом с инкапсулированным доксорубицином (Doxil (зарегистрированная торговая марка) 20MG, коммерчески доступных от Janssen Pharma, Inc.), степень высвобождения из липосом измеряли в плазме без добавления хлорида аммония (изготовитель LAMPIRE Biological Laboratories, Inc., плазма мыши, название продукта: Плазма Контрольной и Донорной Мыши в Na Hep, № по каталогу 7315511) и в плазме, в которой растворяли 5 ммоль/л хлорида аммония. Результаты показаны на Фиг. 6. В опухолевой среде разложение глутамина усиливается, и, как результат, образуется большое количество аммония, и сообщалось о присутствии примерно 5 ммоль/л аммония (цитируемая статья: Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 11 (2015) 1841–1850).

[0151] Doxil (зарегистрированная торговая марка) 20MG представляет собой липосому с инкапсулированным доксорубицином, образованную из HSPC. Doxil (зарегистрированная торговая марка) демонстрирует очень небольшую утечку в среде, которая имитирует кровь, но, как оказалось, высвобождение практически отсутствует даже в среде с высоким содержанием аммония, которая имитирует опухолевую среду.

С другой стороны, липосома, содержащая топотекан, которая описана в Примере 17 настоящего изобретения, демонстрирует очень низкую утечку в среде, которая имитирует кровь, приводя, таким образом, к высокому удержанию в крови, при этом она демонстрирует очень высокое высвобождение 86% в среде с высоким содержанием аммония, которая имитирует опухолевую среду, а не протекает в крови, приводя, таким образом, к ожидаемому результату, когда высокое количество лекарственного средства доставляется к опухоли липосомой, и лекарственное средство, переносимое липосомой, высвобождается в больших количествах в опухоли. Результаты показаны на Фиг. 6.

[0152] Кроме того, опухоль, полученную путем непосредственной трансплантации клеточной линии рака яичника человека ES–2 подкожно “голой” мыши BALB/c, собирали и помещали на центрифужный фильтр с размером пор 5 мкм с последующим центрифугированием при 400g в течение 10 минут с получением опухолевой интерстициальной жидкости. Содержащие топотекан липосомы (30 нг в расчете на количество лекарственного средства) по настоящему изобретению, полученные в Примере 17, и HSPC липосомы с инкапсулированным доксорубицином (Doxil (зарегистрированная торговая марка) 20MG, коммерчески доступные от Janssen Pharma, Inc.) (30 нг в расчете на количество лекарственного средства), соответственно, добавляли к 30 мкл опухолевой интерстициальной жидкости с последующей инкубацией. Высвобождение в случае инкубации при 37°C в течение 24 часов составило 85% в Примере 17 и 6% в HSPC липосомах с инкапсулированным доксорубицином, таким образом показывая, что разница в высвобождении наблюдалась, как и ожидали, в опухолевой интерстициальной жидкости, собранной из действительной опухолевой среды.

Реферат

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к липосомальной композиции для инкапсулирования лекарственного средства, включающей: липосомы, каждая из которых имеет внутреннюю водную фазу, и водный раствор, который составляет внешнюю водную фазу и в котором диспергированы липосомы, где липосома включает гидрофильный полимер–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин; дигидросфингомиелин; и холестерины; где каждая липосома композиции инкапсулирует лекарственное средство; где гидрофильный полимер–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин представляет собой полиэтиленгликоль– или метоксиполиэтиленгликоль–модифицированный диацилфосфатидилэтаноламин; где дигидросфингомиелин представляет собой дигидросфингомиелин, имеющий длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 16 атомов углерода, и длинноцепочечную алкильную группу, содержащую 18 атомов углерода; где лекарственное средство представляет собой противораковое лекарственное средство; где внутренняя водная фаза содержит сульфат аммония, и молярное отношение сульфат–ионов во внутренней водной фазе к сумме лекарственного средства во внутренней водной фазе и во внешней водной фазе составляет 0,36 или больше, а также относится к способу лечения ракового заболевания. Группа изобретений обеспечивает получение композиции, которая демонстрирует высокие значения AUC. 5 н. и 11 з.п. ф-лы, 6 ил., 7 табл.

Формула