Улучшенное выявление коротких гомополимерных повторов - RU2018113750A
Код документа: RU2018113750A
Формула
1. Способ выявления изменений в числе нуклеотидов, присутствующих в последовательности гомополимерных нуклеотидных повторов, длина которой составляет 15 п. о. или меньше, при этом способ включает стадии:
- получения ампликонов путем амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей целевую последовательность гомополимерных повторов;
- нагревания полученных ампликонов в присутствии по меньшей мере одного генерирующего сигнал олигонуклеотидного зонда, содержащего последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью гомополимерных повторов, и выявления изменений в интенсивности сигнала, генерируемого указанным зондом, в зависимости от температуры с получением по меньшей мере одной кривой плавления; и
- установления числа нуклеотидов, присутствующих в целевой последовательности гомополимерных повторов, на основании по меньшей мере одной кривой плавления.
2. Способ по п. 1, где последовательность, способная гибридизироваться с целевой последовательностью гомополимерных повторов, предусматривает последовательность, идентичную или комплементарную мутантной форме последовательности, предусматривающей делецию по меньшей мере одного гомонуклеотида в указанной целевой последовательности гомополимерных повторов.
3. Способ по п. 1 или 2, где олигонуклеотидный зонд представляет собой олигонуклеотидный зонд типа «молекулярный маяк».
4. Способ по п. 3, где применяют по меньшей мере второй олигонуклеотидный зонд типа «молекулярный маяк», меченый другим способом, чем первый олигонуклеотидный зонд типа «молекулярный маяк», где указанный второй олигонуклеотидный зонд типа «молекулярный маяк» содержит последовательность, способную гибридизироваться со второй целевой последовательностью гомополимерных нуклеотидных повторов, отличающейся от первой целевой последовательности гомополимерных нуклеотидных повторов.
5. Способ по п. 4, где последовательность, способная гибридизироваться со второй целевой последовательностью гомополимерных нуклеотидных повторов, предусматривает последовательность, идентичную или комплементарную мутантной форме последовательности, предусматривающей делецию по меньшей мере одного гомонуклеотида в указанной второй целевой последовательности гомополимерных повторов.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадию получения ампликонов выполняют с помощью ПЦР, предусматривающей полимеразу, обладающую 3’-5’ экзонуклеазной активностью.
7. Способ по п. 6, где по меньшей мере один генерирующий сигнал меченый олигонуклеотидный зонд имеет структурный признак или модификацию, обеспечивающие защиту указанного зонда от 3’-5’ экзонуклеазной активности полимеразы, при этом указанные структурный признак или модификация предпочтительно выбраны из:
- инвертированного dT на 3’-конце зонда;
- по меньшей мере одной фосфотиоатной связи, расположенной перед любым из последних трех нуклеотидов на 3’-конце зонда.
8. Способ по п. 7, где специфический в отношении последовательности зонд представляет собой олигонуклеотидный зонд типа «молекулярный маяк», и где указанные структурный признак или модификация представляют собой устойчивый к 3’-5’ экзонуклеазной активности «стебель».
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадии:
- получения ампликонов путем амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей целевую последовательность гомополимерных повторов;
- нагревания полученных ампликонов в присутствии по меньшей мере одного генерирующего сигнал олигонуклеотидного зонда и выявления изменений в интенсивности указанного сигнала в зависимости от температуры с получением по меньшей мере одной кривой плавления; и
- установления числа нуклеотидов, присутствующих в целевой последовательности гомополимерных повторов, на основании по меньшей мере одной кривой плавления,
выполняют в автоматизированной системе.
10. Способ по п. 9, при этом указанному способу предшествует любая из следующих стадий:
- обеспечение источника нуклеиновой кислоты, вероятно содержащей целевую последовательность гомополимерных повторов, при этом указанный источник предпочтительно представляет собой биологический образец;
- обеспечение высвобождения и/или выделение нуклеиновой кислоты, вероятно содержащей целевую последовательность гомополимерных повторов, из источника нуклеиновой кислоты;
- обеспечение указанной высвобожденной и/или очищенной нуклеиновой кислоты, вероятно содержащей целевую последовательность гомополимерных повторов, для стадии получения ампликонов;
где по меньшей мере стадии:
- обеспечения высвобождения и/или выделения нуклеиновой кислоты, вероятно содержащей целевую последовательность гомополимерных повторов, из источника нуклеиновой кислоты;
- обеспечения указанной высвобожденной и/или очищенной нуклеиновой кислоты, вероятно содержащей целевую последовательность гомополимерных повторов, для стадии получения ампликонов;
также выполняют в автоматизированной системе.
11. Способ по п. 10, где по меньшей мере стадии:
- обеспечения высвобождения и/или выделения нуклеиновой кислоты, вероятно содержащей целевую последовательность гомополимерных повторов, из источника нуклеиновой кислоты;
- обеспечения указанной высвобожденной и/или очищенной нуклеиновой кислоты, вероятно содержащей целевую последовательность гомополимерных повторов, для стадии получения ампликонов;
- получения ампликонов путем амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей целевую последовательность гомополимерных повторов; и
- нагревания полученных ампликонов в присутствии генерирующего сигнал олигонуклеотидного зонда и выявления изменений в интенсивности указанного сигнала в зависимости от температуры с получением по меньшей мере одной кривой плавления;
выполняют в картридже, выполненном с возможностью взаимодействия с указанной автоматизированной системой.
12. Способ по любому из предыдущих пунктов, где установление числа нуклеотидов, присутствующих в целевой последовательности гомополимерных повторов, на основании по меньшей мере одной кривой плавления выполняют путем оценки положения или относительного положения по меньшей мере одного пика исходя из первой производной указанной кривой плавления, и предпочтительно выполняют автоматизированным способом.
13. Набор для выявления изменений в числе нуклеотидов, присутствующих в целевой последовательности гомополимерных нуклеотидных повторов, длина которой составляет 15 п. о. или меньше, при этом указанный набор содержит по меньшей мере один, предпочтительно множество олигонуклеотидных зондов типа «молекулярный маяк», каждый из которых содержит последовательность, способную гибридизироваться с последовательностью, содержащей отличающуюся целевую последовательность гомополимерных повторов, длина которой составляет 15 п. о. или меньше; и предпочтительно указанный набор дополнительно содержит корректирующую полимеразу.
14. Набор по п. 13, где указанные по меньшей мере один, предпочтительно множество олигонуклеотидных зондов типа «молекулярный маяк», и предпочтительно также корректирующая полимераза предусмотрены в картридже, выполненном с возможностью взаимодействия с автоматизированной системой.
15. Применение способа по любому из пп. 1-12 для выявления микросателлитной нестабильности (MSI), предпочтительно в образце, полученном от пациента, у которого диагностирован рак или который предположительно страдает им.
16. Применение набора по любому из пп. 13-14 для выявления микросателлитной нестабильности (MSI), предпочтительно в образце, полученном от пациента, у которого диагностирован рак или который предположительно страдает им.
