Направленная интеграция - RU2016101246A

1. Выделенная клетка, содержащая по меньшей мере одну экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, расположенную в геномной ДНК в пределах по меньшей мере одного геномного локуса или проксимально к по меньшей мере одному геномному локусу, указанному в таблице 2, гдегде каждая последовательность экзогенной нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одну последовательность распознавания для фермента модификации полинуклеотида.

2. Выделенная клетка по п.1, где клетка представляет собой клетку CHO.

3. Выделенная клетка по п.1 или 2, где по меньшей мере одна последовательность распознавания содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая не существует эндогенно в геноме клетки.

4. Выделенная клетка по п.1, где фермент модификации полинуклеотида выбран из группы, состоящей из нацеливающей эндонуклеазы, сайт-специфичной рекомбиназы и их комбинаций.

5. Выделенная клетка по п.4, где нацеливающая эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы с цинковым пальцем (ZFN), мегануклеазы, эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN), эндонуклеазы CRIPSR, нуклеазы I-Tevl или родственного мономерного гибрида, и искусственного агента, индуцирующего направленный двухцепочечный разрыв ДНК.

6. Выделенная клетка по п.4, где сайт-специфичная рекомбиназа выбрана из группы, состоящей из лямбда-интегразы, Cre-рекомбиназы, рекомбиназы FLP, резольвазы гамма-дельта, резольвазы Tn3, интегразы PhiC31, интегразы Bxb1 и интегразы R4.

7. Выделенная клетка по любому из предыдущих пунктов, где первая последовательность распознавания распознается первой парой ZFN.

8. Выделенная клетка п.7, где вторая последовательность распознавания распознается второй парой ZFN, которая отличается от первой пары ZFN.

9. Выделенная клетка по п.7 или 8, где первая и вторая пары ZFN выбраны из группы, состоящей из hSIRT, hRSK4 и hAAVS1.

10. Выделенная клетка по любому из предшествующих пунктов, где экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно содержит по меньшей мере одну последовательность селектируемого маркера, по меньшей мере одну репортерную последовательность, по меньшей мере один элемент с регуляторной контрольной последовательностью или их комбинацию.

11. Способ получения клетки, содержащей по меньшей мере одну экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит по меньшей мере одну последовательность распознавания для фермента модификации полинуклеотида, причем указанный способ включает:

а) введение в клетку по меньшей мере одной нацеливающей эндонуклеазы, которая нацелена на последовательность, расположенную в пределах геномного локуса, указанного в таблице 2, или проксимально к нему,

b) введение в клетку по меньшей мере одного донорного полинуклеотида, содержащего экзогенную нуклеиновую кислоту, которая фланкирована (i) последовательностями, имеющими существенную степень идентичности по отношению к последовательности геномного локуса-мишени или (ii) последовательностью распознавания нацеливающей эндонуклеазы; и

c) поддержание клетки в таких условиях, что экзогенная нуклеиновая кислота становится интегрированной в геном этой клетки.

12. Способ по п.11, где клетка представляет собой клетку CHO.

13. Способ по п.11 или 12, где экзогенная нуклеиновая кислота интегрирована в геном посредством направляемого гомологией способа.

14. Способ по п.11 или 12, где экзогенная нуклеиновая кислота интегрирована в геном способом прямого лигирования.

15. Способ согласно любому из пп.11-14, где нацеливающая эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы с цинковым пальцем (ZFN), мегануклеазы, эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN), эндонуклеазы CRIPSR, нуклеазы I-Tevl или родственного мономерного гибрида, и искусственного агента, индуцирующего направленный двухцепочечный разрыв ДНК.

16. Способ перенацеливания клетки для выработки по меньшей мере одного рекомбинантного белка, причем указанный способ включает:

а) получение клетки, содержащей по меньшей мере одну экзогенную последовательность распознавания для фермента модификации полинклеотида, которая расположена в пределах по меньшей мере одного геномного локуса, указанного в таблице 2, или проксимально к этому по меньшей мере одному геномному локусу;

b) введение в клетку (i) по меньшей мере одной экспрессионной конструкции, содержащей кодирующую рекомбинантный белок последовательность, которая фланкирована первой и второй последовательностями, и (ii) по меньшей мере одного фермента модификации полинклеотида, который распознает, по меньшей мере одну экзогенную последовательность распознавания в клетке;

в) поддержание клетки в таких условиях, что кодирующая рекомбинантный белок последовательность становится интегрированной в геном клетки.

17. Способ по п.16, где клетка представляет собой клетку CHO.

18. Способ по п.16 или 17, где по меньшей мере одна экзогенная последовательность распознавания в клетке представляет собой сайт распознавания нацеливающей эндонуклеазы; первая и вторая последовательности экспрессионной конструкции являются последовательностями с существенной степенью идентичности по отношению к хромосомальной последовательности, расположенной вблизи экзогенной последовательности распознавания в клетке; и по меньшей мере один фермент модификации полинуклеотида представляет собой нацеливающую эндонуклеазу.

19. Способ по п.16 или 17, где по меньшей мере одна экзогенная последовательность распознавания в клетке представляет собой сайт распознавания нацеливающей эндонуклеазы; каждая из первой и второй последовательностей экспрессионной конструкции является последовательностью распознавания нацеливающей эндонуклеазы; и по меньшей мере один фермент модификации полинуклеотида представляет собой нацеливающую эндонуклеазу.

20. Способ по п.18 или 19, где нацеливающая эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы с цинковым пальцем (ZFN), мегануклеазы, эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN), эндонуклеазы CRIPSR, нуклеазы I-Tevl или родственного мономерного гибрида, и искусственного агента, индуцирующего направленный двухцепочечный разрыв ДНК.

21. Способ по п.16 или 17, где по меньшей мере одна экзогенная последовательность распознавания в клетке является сайтом распознавания сайт-специфичной рекомбиназы; каждая из первой и второй последовательностей экспрессионной конструкции является последовательностью распознавания сайт-специфичной рекомбиназы; и по меньшей мере один фермент модификации полинуклеотида представляет собой сайт-специфичную рекомбиназу.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что сайт-специфичная рекомбиназа выбрана из группы, состоящей из лямбда-интегразы, Cre-рекомбиназы, рекомбиназы FLP, резольвазы гамма-дельта, резольвазы Tn3, интегразы PhiC31, интегразы Bxb1 и интегразы R4.

23. Способ по любому из пп.16-22, где последовательность, кодирующая рекомбинантный белок, функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии.

24. Способ по любому из пп.16-23, где экспрессионная конструкция дополнительно содержит по меньшей мере одну последовательность селектируемого маркера, по меньшей мере одну репортерную последовательность, по меньшей мере один элемент с регуляторной контрольной последовательностью или их комбинацию.

25. Способ по любому из пп.16-24, где клетки содержатся в условиях, позволяющих экспрессию по меньшей мере одного рекомбинантного белка.

26. Набор для перенацеливания клетки для выработки рекомбинантного белка, причем указанный набор содержит клетку по любому из пп.1-10, вместе с ферментом модификации полинуклеотида, соответствующим последовательности распознавания, и конструкцию для вставки последовательности, которая кодирует представляющий интерес рекомбинантный белок, где указанная конструкция дополнительно содержит пару фланкирующих последовательностей, которые соответствуют последовательности распознавания и/или геномной ДНК, фланкирующей последовательности распознавания.

27. Набор по п.26, дополнительно содержащий инструкции для выполнения направленной интеграции последовательности, которая кодирует рекомбинантный белок.

28. Набор по п.26 или 27, где фермент модификации полинуклеотида представляет собой нацеливающую эндонуклеазу, которая выбрана из группы, состоящей из нуклеазы с цинковым пальцем (ZFN), мегануклеазы, эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN), эндонуклеазы CRIPSR, нуклеазы I-Tevl или родственного мономерного гибрида, и искусственного агента, индуцирующего направленный двухцепочечный разрыв ДНК.

29. Набор по п.26 или 27, где фермент модификации полинуклеотида представляет собой сайт-специфичную рекомбиназу, которая выбрана из группы, состоящей из лямбда-интегразы, Cre-рекомбиназы, рекомбиназы FLP, резольвазы гамма-дельта, резольвазы Tn3, интегразы PhiC31, интегразы Bxb1 и интегразы R4.