Трансформация хлоропластов ряски - RU2006102864A

Реферат

1. Растение ряски, содержащее пластиды, которые трансформированы, по меньшей мере, одной нуклеотидной последовательностью, гетерологичной пластому ряски, причем нуклеотидная последовательность, гетерологичная пластому ряски, функционально связана с контролирующей экспрессию последовательностью, способной функционировать в пластидах.

2. Растение ряски по п.1, у которого, по меньшей мере, одна нуклеотидная последовательность, гетерологичная пластому ряски, кодирует целевой полипептид.

3. Растение ряски по п.2, у которого целевой полипептид выбран из группы, состоящей из инсулина, гормона роста, α -интерферона, β -интерферона, β-глюкоцереброзидазы, β-глюкуронидазы, белка ретинобластомы, белка р53, ангиостатина, лептина, эритропоетина, колониестимулирующего фактора гранулоцитов/макрофагов, плазминогена, моноклональных антител, фрагментов Fab, одноцепочечных антител, цитокинов, рецепторов, вакцин для человека, вакцин для животных, растительных полипептидов, пептидов и сывороточного альбумина.

4. Растение ряски по п.1, у которого пластиды трансформированы, по меньшей мере, двумя нуклеотидными последовательностями, гетерологичными пластому ряски, которые кодируют целевой полипептид.

5. Растение ряски по п.1, у которого нуклеотидная последовательность, гетерологичная пластому ряски, включает кодирующую последовательность для маркерного полипептида, который может быть использован для селекции растительных клеток.

6. Растение ряски по п.5, у которого маркерный полипептид придает устойчивость, по меньшей мере, к одному антибиотику, выбранному из группы, состоящей из спектиномицина и стрептомицина.

7. Растение ряски по п.1, у которого пластиды, трансформированные, по меньшей мере, одной нуклеотидной последовательностью, гетерологичной пластому ряски, выбраны из группы, состоящей из пропластид, амилопластов, хромопластов, хлоропластов, этиопластов или лейкопластов.

8. Растение ряски по п.7, у которого пластиды, трансформированные, по меньшей мере, одной нуклеотидной последовательностью, гетерологичной пластому ряски, представляют собой хлоропласта.

9. Растение ряски по п.1, у которого контролирующая экспрессию последовательности, функционирующая в пластидах, представляет собой последовательность промотора 16S-pPHK растения.

10. Растение ряски по п.9, у которого контролирующая экспрессию последовательности, функционирующая в пластидах, представляет собой последовательность промотора 16S-pPHK табака.

11. Растение ряски по п.10, у которого последовательность промотора 16S-pPHK табака представляет собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:6.

12. Растение ряски по п.1, причем оно выбрано из группы, состоящей из рода Spirodela, рода Wolffia, рода Wolfiella и рода Lemna.

13. Растение ряски по п.12, причем оно выбрано из группы, состоящей из Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctiaUs и Lemna gibba.

14. Фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий в виде функционально связанных компонентов следующие нуклеотидные последовательности:

a) первую нуклеотидную последовательность-мишень, гомологичную последовательности пластома ряски,

b) нуклеотидную последовательность экспрессионной кассеты, включающей, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую целевой полипептид, причем данная нуклеотидная последовательность, кодирующая целевой полипептид, гетерологична пластому ряски, и

c) вторую направляющую нуклеотидную последовательность, гомологичную последовательности пластома ряски.

15. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.14, в котором экспрессионная кассета дополнительно включает контролирующую экспрессию последовательности, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей целевой полипептид.

16. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.14, в котором контролирующая экспрессию последовательность, функционирующая в пластидах, представляет собой последовательность промотора 16S-pPHK табака.

17. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.16, в котором последовательность промотора 16S-pPHK табака представляет собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:6.

18. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.14, дополнительно включающий, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность участка связывания рибосом, функционирующего в ряске.

19. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.18, в котором участок связывания рибосом, функционирующий в ряске, включает нуклеотидную последовательность участка связывания рибосом rbcL табака, приведенную в SEQ ID NO:7.

20. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.14, дополнительно включающий терминирующую последовательность транскрипции.

21. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.20, в котором терминирующая последовательность транскрипции представляет собой нуклеотидную последовательность 3'-нетранслируемого участка гена psbA табака, приведенную в SEQ ID NO:8.

22. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.14, в котором, по меньшей мере, один целевой полипептид является маркерным полипептидом, который может быть использован для селекции трансформированных клеток ряски.

23. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.22, в котором маркерный полипептид придает устойчивость к антибиотику, выбранному из группы, состоящей из стрептомицина и спектиномицина.

24. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.14, в котором первая и вторая направляющие нуклеотидные последовательности способны вызывать гомологическую рекомбинацию в пределах пластома ряски.

25. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.14, причем пластиды ряски представляют собой хлоропласты ряски, и пластом ряски представляет собой геном хлоропластов.

26. Хлоропласты ряски, содержащие фрагменты нуклеиновой кислоты по п.14.

27. Клетки ряски, содержащие хлоропласты по п.26.

28. Растения ряски, содержащие клетки ряски по п.27.

29. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.14, в котором, по меньшей мере, одна нуклеотидная последовательность, выбранная из первой нуклеотидной последовательности-мишени и второй нуклеотидной последовательности-мишени, гомологична нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3.

30. Фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий в виде функционально связанных компонентов следующие нуклеотидные последовательности:

a) первую нуклеотидную последовательность-мишень, гомологичную последовательности генома хлоропластов ряски,

b) контролирующую экспрессию последовательность, функционирующую в ряске,

c) нуклеотидную последовательность участка связывания рибосом, функционирующего в ряске,

d) нуклеотидную последовательность, гетерологичную геному хлоропластов ряски, причем данная нуклеотидная последовательность, гетерологичная геному хлоропластов ряски, кодирует целевой полипептид,

e) терминирующую последовательность транскрипции, функционирующую в ряске,

f) вторую нуклеотидную последовательность-мишень, гомологичную последовательности генома хлоропластов ряски.

31. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.30, в котором, по меньшей мере, одна нуклеотидная последовательность, выбранная из первой нуклеотидной последовательности-мишени и второй нуклеотидной последовательности-мишени, гомологична нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3.

32. Хлоропласты ряски, содержащие фрагмент нуклеиновой кислоты по п.30.

33. Клетки ряски, содержащие хлоропласты по п.32.

34. Растения ряски, содержащие клетки ряски по п.33.

35. Способ введения, по меньшей мере, одной нуклеотидной последовательности, гетерологичной пластому ряски, в пластиды ряски, включающий бомбардирование узелков ряски молекулами нуклеиновой кислоты по п.14, абсорбированными на микроснаряде, в таких условиях, что данная нуклеотидная последовательность, гетерологичная пластому ряски, вводится, по меньшей мере, в одну пластиду узелка ряски.

36. Способ по п.35, в котором пластиды ряски представляют собой хлоропласты ряски.

37. Пластиды ряски, содержащие, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, гетерологичную пластому ряски, причем данные пластиды ряски, содержащие, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, гетерологичную пластому ряски, получены способом по п.35.

38. Клетки ряски, содержащие пластиды ряски по п.37.

39. Растения ряски, содержащие клетки ряски по п.38.

40. Способ получения транспластомных растений ряски, включающий стадии

a) бомбардирования узелков ряски молекулами нуклеиновой кислоты по п.14, абсорбированными на микроснаряде, в таких условиях, что данная нуклеотидная последовательность, гетерологичная пластому ряски, вводится, по меньшей мере, в одну пластиду узелка ряски, и

b) регенерирования растений ряски из данных узелков ряски.

41. Транспластомные растения ряски, полученные способом по п.40.

42. Способ получения растений ряски, содержащих стабильно трансформированные пластиды, включающий стадии

a) получения фрагментов нуклеиновой кислоты по п.14, причем данные фрагменты нуклеиновой кислоты включают последовательность маркера, придающего селективный фенотип клеткам ряски,

b) бомбардирования узелков ряски данными молекулами нуклеиновой кислоты, абсорбированными на микроснаряде, в таких условиях, что данная нуклеотидная последовательность, гетерологичная пластому ряски, вводится, по меньшей мере, в одну пластиду узелка ряски,

c) содержания узелков ряски в селективной среде, которая позволяет выживать клеткам ряски с селективным фенотипом, тем самым осуществляя селекцию клеток ряски, содержащих последовательность маркера, и

d) регенерирования растений ряски из данных узелков ряски.

43. Способ по п.42, в котором селективная среда предпочтительно позволяет выживание тех клеток ряски, у которых практически все пластиды трансформированы молекулами нуклеиновой кислоты.

44. Транспластомные растения ряски, полученные в соответствии со способом по п.42.

45. Способ получения целевого полипептида, включающий

a) бомбардирование узелков ряски молекулами нуклеиновой кислоты по п.14, абсорбированными на микроснаряде, в таких условиях, что данная нуклеотидная последовательность, гетерологичная пластому ряски, вводится, по меньшей мере, в одну пластиду узелка ряски, и

b) культивирование растений ряски в таких условиях, что целевой полипептид экспрессируется из данных молекул нуклеиновой кислоты.

46. Способ получения целевого полипептида, включающий

a) бомбардирование узелков ряски молекулами нуклеиновой кислоты по п.14, абсорбированными на микроснаряде, в таких условиях, что данная нуклеотидная последовательность, гетерологичная пластому ряски, вводится, по меньшей мере, в одну пластиду узелка ряски,

b) регенерирование растений ряски из данных узелков ряски, и

c) культивирование растений ряски в таких условиях, что целевой полипептид экспрессируется из данных молекул нуклеиновой кислоты.

47. Клетки ряски, содержащие пластиды, стабильно трансформированные, по меньшей мере, одной нуклеотидной последовательностью, гетерологичной пластому ряски, причем нуклеотидная последовательность, гетерологичная пластому ряски, функционально связана с контролирующей последовательностью экспрессии, способной функционировать в пластидах.

48. Способ получения одного или нескольких целевых полипептидов, включающий

a) получение клеток ряски по п.27, причем нуклеотидная последовательность, гетерологичная пластому ряски, кодирует один или несколько целевых полипептидов, и

b) культивирование клеток ряски в таких условиях, что экспрессируется целевой полипептид.

49. Фрагмент нуклеиновой кислоты, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

a) нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3,

b) нуклеотидной последовательности фрагмента нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3, причем данный фрагмент содержит, по меньшей мере, 100 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3,

c) нуклеотидной последовательности фрагмента нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3, причем данный фрагмент содержит, по меньшей мере, 200 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3,

d) нуклеотидной последовательности фрагмента нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3, причем данный фрагмент содержит, по меньшей мере, 400 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3,

e) нуклеотидной последовательности фрагмента нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3, причем данный фрагмент содержит, по меньшей мере, 600 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3,

f) нуклеотидной последовательности фрагмента нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3, причем данный фрагмент содержит, по меньшей мере, 800 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3,

g) нуклеотидной последовательности фрагмента нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3, причем данный фрагмент содержит, по меньшей мере, 1000 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3,

h) нуклеотидной последовательности, последовательность которой, по меньшей мере, на 90% идентична нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3, причем данная нуклеотидная последовательность, последовательность которой, по меньшей мере, на 99% идентична SEQ ID NO:3, способна к гомологической рекомбинации с геномом хлоропластов ряски, и

i) нуклеотидной последовательности, последовательность которой, по меньшей мере, на 95% идентична нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3, причем данная нуклеотидная последовательность, последовательность которой, по меньшей мере, на 95% идентична SEQ ID NO:3, способна к гомологической рекомбинации с геномом хлоропластов ряски.