Универсальная донорная система для направленного воздействия на гены - RU2016122038A

1. Полинуклеотидная донорная кассета, которая содержит связующий домен сайт-специфической нуклеазы, аналитический домен и плазмидный домен.

2. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой полинуклеотидная донорная кассета содержит отрезок меньше чем 3 т.п.о.

3. Трансгенная клетка, которая содержит полинуклеотидную донорную кассету по п. 1.

4. Трансгенная клетка по п. 3, в котором клетка представляет собой трансгенную клетку растения.

5. Трансгенное растение, которое содержит трансгенную клетку растения по п. 4.

6. Трансгенное растение по п. 5, в котором растение представляет собой односемядольное растение.

7. Трансгенное растение по п. 6, в котором односемядольное растение выбирают из группы, состоящей из растения кукурузы, растения пшеницы и растения риса.

8. Трансгенное растение по п. 5, в котором растение представляет собой двусемядольное растение.

9. Трансгенное растение по п. 8, в котором двусемядольное растение выбирают из группы, состоящей из растения соевых бобов, растения хлопка и растения канолы.

10. Трансгенное семя от трансгенного растения по п. 5.

11. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в котором полинуклеотидная донорная кассета содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 132, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 133, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 134, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 135, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 136, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 137, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 138, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 139, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 140 и полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 141.

12. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой связующий домен сайт-специфической нуклеазы содержит две или более связующих последовательностей сайт-специфической нуклеазы.

13. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой связующий домен сайт-специфической нуклеазы связывает связующий белок с цинковыми пальцами, связующий белок мегануклеазы, CRISPR-связующий белок или TALEN связующий белок.

14. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой аналитический домен выбирают из группы, состоящей из полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 142 и полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 143.

15. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1 или 14, в которой аналитический домен содержит одну или несколько последовательностей рестрикционных ферментов.

16. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1 или 14, в которой аналитический домен имеет процентную долю пары оснований гуанин и цитозин приблизительно от 40 приблизительно до 60%.

17. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1 или 14, в которой аналитический домен содержит полинуклеотид, который не содержит какие-либо повторяющиеся последовательности, имеющие длину больше чем 9 пар оснований.

18. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 11, в которой аналитический домен содержит полинуклеотид, который не содержит серию последовательностей из идентичных пар оснований больше чем 9 п.о. в длину.

19. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой аналитический домен содержит полинуклеотид со вторичной структурой больше чем 19 ккал/моль свободной энергии (ΔG).

20. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой аналитический домен содержит одну или несколько связующих праймеры последовательностей.

21. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой полинуклеотидная донорная кассета содержит одну или несколько последовательностей гомологичных звеньев.

22. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 21, в которой одна или несколько последовательностей гомологичных звеньев составляет между 50 и 100 парами оснований в длину.

23. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 21, в которой одна или несколько последовательностей гомологичных звеньев имеют по меньшей мере 80% идентичности последовательностей с оптимальными геномными локусами.

24. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 23, в которой оптимальные геномные локусы выбирают из группы, состоящей из оптимальные_локусы_204637, оптимальные_локусы_204726, оптимальные_локусы_156393, оптимальные_локусы_198387, оптимальные_локусы_31710, оптимальные_локусы_64542, оптимальные_локусы_197372, оптимальные_локусы_232228, оптимальные_локусы_285621 и оптимальные_локусы_157315.

25. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой аналитический домен не кодирует пептид.

26. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой аналитический домен кодирует пептид.

27. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 26, в которой аналитический домен содержит кассету экспрессии гена, которая содержит трансген.

28. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 27, в которой кассета экспрессии гена содержит промотор.

29. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 27, в которой трансген содержит репортерный ген.

30. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 29, в которой репортерный ген выбирают из группы, состоящей из гена yfp, гена gus, гена rfp, гена gfp, гена устойчивости к канамицину, гена aad-1, гена aad-12, гена pat и гена устойчивости к глифосату.

31. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой плазмидный домен содержит плазмиду pUC19.

32. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой плазмидный домен содержит высококопийный участок начала репликации.

33. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 32, в которой высококопийный участок начала репликации содержит участок начала репликации cole1.

34. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой плазмидный домен содержит селективный маркер.

35. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 30, в которой селективный маркер выбирают из группы, состоящей из канамицинового селективного маркера, ампициллинового селективного маркера, спектиномицинового селективного маркера, хлорамфениколового селективного маркера и рифампицинового селективного маркера.

36. Способ направленного встраивания полинуклеотидной донорной кассеты в геном клетки растения, способ включает:

a. экспрессию сайт-специфической ДНК-связующей нуклеазы, которая содержит по меньшей мере один ДНК-связующий домен и по меньшей мере один домен нуклеазы, в которой по меньшей мере один ДНК-связующий домен связывается с сайтом-мишенью в геноме клетки растения;

b. приведение в контакт клетки растения с полинуклеотидной донорной кассетой по п. 1;

c. расщепление сайта-мишени в геноме клетки растения с использованием сайт-специфической ДНК-связующей нуклеазы; и,

d. встраивание полинуклеотидной донорной кассеты по п. 1 в сайт-мишень в геноме клетки растения.

37. Способ по п. 36, в котором по меньшей мере один ДНК-связующий домен выбирают из группы, состоящей из связующего домена цинкового пальца, связующего домена мегануклеазы, TALEN-связующего домена, мегануклеазы и CRISPR связующего домена.

38. Способ по п. 36, в котором домен нуклеазы из рестрикционной эндонуклеазы IIS типа.

39. Способ по п. 38, в котором рестрикционную эндонуклеазу IIS типа выбирают из группы, состоящей из FokI и StsI.

40. Способ по п. 36, в котором полинуклеотидная донорная кассета экспрессирует полипептид.

41. Способ по п. 36, в котором полинуклеотидная донорная кассета содержит некодирующую последовательность нуклеиновой кислоты.

42. Способ по п. 36, в котором полинуклеотидная донорная кассета содержит одну или несколько связующих последовательностей цинковых пальцев.

43. Способ по п. 36, в котором полинуклеотидная донорная кассета содержит одну или несколько связующих праймеры последовательностей.

44. Способ по п. 36, в котором встраивание включает в себя механизм репарации по гомологии.

45. Способ по п. 36, в котором встраивание включает в себя механизм репарации через соединение негомологичных концов.

46. Способ по п. 36, в котором клетка растения представляет собой клетку односемядольного растения.

47. Способ по п. 46, в котором клетку односемядольного растения выбирают из группы, состоящей из клетки растения кукурузы, клетки растения пшеницы и клетки растения риса.

48. Способ по п. 36, в котором клетка растения представляет собой двусемядольное растение.

49. Способ по п. 48, в котором клетку двусемядольного растения выбирают из группы, состоящей из клетки растения соевых бобов, клетки растения хлопка и клетки растения канолы.

50. Способ по п. 36, в котором сайт-мишень содержит оптимальные геномные локусы.

51. Способ по п. 50, в котором оптимальные геномные локусы представляют собой гипометилированные негенные последовательности, обладающие следующими характеристиками:

a. уровень метилирования указанной негенной последовательности составляет 1% или меньше;

b. указанная негенная последовательность имеет меньше чем 40% идентичности последовательностей с какой-либо другой последовательностью, содержащейся в геноме;

c. указанная негенная последовательность находится в пределах области в 40 т. о. от известной или предсказанной экспрессионной кодирующей последовательности; и,

d. указанная негенная последовательность демонстрирует частоту рекомбинации в геноме больше чем 0,00041 сМ/млн. о.