Биотехнологическое получение lnt, lnnt и их фукозилированных производных - RU2017104525A
Код документа: RU2017104525A
Формула
1. Генетически модифицированный микроорганизм для in vivo синтеза лакто-N-тетраозы, причем микроорганизм содержит
(i) первый трансген, который кодирует β 1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу,
и
(ii) второй трансген, который кодирует β 1,3-галактозилтрансферазу.
2. Генетически модифицированный микроорганизм для in vivo синтеза лакто-N-неотетраозы, причем микроорганизм содержит
(i) первый трансген, который кодирует β 1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу,
и
(ii) второй трансген, который кодирует β 1,4-галактозилтрансферазу.
3. Генетически модифицированный микроорганизм по п. 1 или 2, причем указанный микроорганизм является дополнительно генетически модифицированным таким образом, что экспрессия LacZ и LacA подавляется.
4. Генетически модифицированный микроорганизм по п. 3, причем (i) первый трансген интегрирован в локус LacZYA, и микроорганизм содержит дополнительный трансген, который кодирует LacY.
5. Генетически модифицированный микроорганизм по п. 4, причем трансген, который кодирует LacY, интегрирован в локус FucIK.
6. Генетически модифицированный микроорганизм по п. 1 или 2, причем указанный микроорганизм содержит дополнительный трансген, который кодирует UDP-caxap-пирофосфорилазу.
7. Генетически модифицированный микроорганизм по п. 1 или 2, причем указанный микроорганизм является дополнительно генетически модифицированным таким образом, что экспрессия UDP-глюкоза-4-эпимеразы подавляется.
8. Генетически модифицированный микроорганизм по п. 1 или 2, в котором один или оба, или один, несколько или все трансгены является или являются хромосомно интегрированными.
9. Генетически модифицированный микроорганизм по п. 1 или 2, причем указанный микроорганизм содержит дополнительный трансген, который кодирует бифункциональный фермент, имеющий активность L-фукозокиназы и L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазы, а также по меньшей мере один трансген, который кодирует фермент, который способен к альфа1,2-фукозилированию, альфа 1,3-фукозилированию или альфа 1,4-фукозилированию.
10. Генетически модифицированный микроорганизм по п. 9, в котором трансген, который кодирует указанный бифункциональный фермент, имеющий активность L-фукозокиназы и L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазы, является хромосомно интегрированным, и по меньшей мере один трансген, который кодирует фермент, который способен к альфа1,2-фукозилированию, альфа1,3-фукозилированию или альфа1,4-фукозилированию, экспрессируется посредством плазмидного вектора.
11. Генетически модифицированный микроорганизм по п. 9, в котором как трансген, который кодирует указанный бифункциональный фермент, имеющий активность L-фукозокиназы и L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазы, так также и по меньшей мере один трансген, который кодирует фермент, который способен к альфа1,2-фукозилированию, альфа 1,3-фукозилированию или альфа1,4-фукозилированию, являются хромосомно интегрированными.
12. Применение генетически модифицированного микроорганизма по любому из предшествующих пунктов для in vivo синтеза лакто-N-тетраозы или лакто-N-неотетраозы или фукозилированных производных лакто-N-тетраозы или лакто-N-неотетраозы.
13. Способ получения лакто-N-тетраозы или лакто-N-неотетраозы или фукозилированных производных лакто-N-тетраозы или лакто-N-неотетраозы, включающий следующие стадии:
(a) обеспечение генетически модифицированного микроорганизма по любому из пп. 1-11,
(b) культивирование указанного генетически модифицированного микроорганизма в условиях, обеспечивающих синтез лакто-N-тетраозы или лакто-N-неотетраозы,
(c) необязательно добавление фукозы,
(d) необязательно выделение синтезированной лакто-N-тетраозы или лакто-N-неотетраозы или фукозилированных производных лакто-N-тетраозы или лакто-N-неотетраозы.
14. Способ по п. 13, в котором на стадии (b)
- галактоза применяется в качестве источника углерода для микроорганизма
или
- глицерин и галактоза применяются в качестве источника углерода для микроорганизма.
15. Способ по п. 13, в котором на стадии (b) непрерывно или периодически добавляют один или более источников углерода, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из лактозы, глюкозы, глицерина, галактозы и любых их смесей.
16. Способ по любому из пп. 13-15, причем указанный способ осуществляется в виде периодического процесса с подпиткой с объемом партии в диапазоне от 2 до 30 л, предпочтительно от 3 до 20 л, особенно предпочтительно от 5 до 15 л.
17. Генетически модифицированный микроорганизм по любому из пп. 1-11, или применение по п. 12 или способ по любому из пп. 13-16, причем генетически модифицированный микроорганизм выбирают из группы, состоящей из бактерий, грибов и растений, предпочтительно из микроорганизмов рода Corynebacterium, Bevibacterium, Bacillus, Saccharomyces и Escherichia.
