Способы и композиции для получения библиотек нуклеиновых кислот - RU2019129451A

1. Способ получения библиотеки нуклеиновых кислот, включающий:

(a) получение множества нуклеиновых кислот, причем указанное множество нуклеиновых кислот представляет собой одноцепочечные нуклеиновые кислоты;

(b) дефосфорилирование 5'-концов одноцепочечных нуклеиновых кислот;

(c) лигирование первого адаптера с 3'-концами одноцепочечных нуклеиновых кислот в присутствии лигазы, причем 3'-конец первого адаптера содержит блокирующую группу;

(d) фосфорилирование 5'-концов лигированных одноцепочечных нуклеиновых кислот; и

(e) лигирование второго адаптера с 5'-концами фосфорилированных лигированных одноцепочечных нуклеиновых кислот в присутствии лигазы, за счет чего получают библиотеку нуклеиновых кислот.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что 5'-конец второго адаптера нефосфорилирован.

3. Способ по п. 1 или 2, характеризующийся тем, что второй адаптер присоединен к подложке.

4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что подложка включает гранулу или проточную ячейку.

5. Способ по п. 1, включающий удаление нелигированных одноцепочечных первых адаптеров до этапа (е).

6. Способ по п. 5, включающий гибридизацию нелигированных одноцепочечных первых адаптеров с зондом захвата.

7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что зонд захвата содержит последовательность, комплементарную по меньшей мере части первого адаптера.

8. Способ по п. 6 или 7, характеризующийся тем, что 3'-конец зонда захвата содержит блокирующую группу.

9. Способ по любому из пп. 6-8, характеризующийся тем, что 5'-конец зонда захвата содержит блокирующую группу.

10. Способ по п. 5, включающий гидролиз нелигированных одноцепочечных первых адаптеров.

11. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что гидролиз нелигированных одноцепочечных первых адаптеров включает приведение нелигированных одноцепочечных первых адаптеров в контакт с 5'-фосфат-зависимой экзонуклеазой.

12. Способ по п. 10 или 11, характеризующийся тем, что гидролиз нелигированных одноцепочечных первых адаптеров включает приведение нелигированных одноцепочечных первых адаптеров в контакт с 5'-фосфат-зависимой экзонуклеазой и 5'-деаденилазой.

13. Способ по любому из пп. 1-12, характеризующийся тем, что фосфорилирование 5'-конца лигированных одноцепочечных нуклеиновых кислот включает приведение лигированных одноцепочечных нуклеиновых кислот в контакт с киназой.

14. Способ получения библиотеки нуклеиновых кислот, включающий:

(a) получение множества нуклеиновых кислот, причем указанное множество нуклеиновых кислот представляет собой двуцепочечные нуклеиновые кислоты;

(b) приведение двуцепочечных нуклеиновых кислот в контакт с 5'-экзонуклеазой с получением множества модифицированных двуцепочечных нуклеиновых кислот с одноцепочечными 3'-выступающими концами;

(c) лигирование первого адаптера с 3'-концами модифицированных двуцепочечных нуклеиновых кислот в присутствии лигазы, причем 3'-конец первого адаптера содержит блокирующую группу;

(d) денатурацию модифицированных двуцепочечных нуклеиновых кислот, лигированных с первыми адаптерами, с получением множества одноцепочечных нуклеиновых кислот; и

(e) лигирование второго адаптера с 5'-концами одноцепочечных нуклеиновых кислот в присутствии лигазы, за счет чего получают библиотеку нуклеиновых кислот.

15. Способ по п. 14, характеризующийся тем, что 5'-конец второго адаптера нефосфорилирован.

16. Способ получения библиотеки нуклеиновых кислот, включающий:

(a) получение множества нуклеиновых кислот, причем указанное множество нуклеиновых кислот представляет собой одноцепочечные нуклеиновые кислоты;

(b) дефосфорилирование 5'-концов одноцепочечных нуклеиновых кислот;

(c) лигирование первого адаптера с 3'-концами одноцепочечных нуклеиновых кислот в присутствии лигазы, причем 3'-конец первого адаптера содержит блокирующую группу;

(d) гибридизацию лигированного первого адаптера с зондом захвата;

(е) удлинение зонда захвата и лигирование второго адаптера с 3'-концом удлиненного зонда захвата в присутствии лигазы, причем 3'-конец второго адаптера содержит блокирующую группу, за счет чего получают библиотеку нуклеиновых кислот.

17. Способ по п. 16, включающий удаление гибридизованного лигированного первого адаптера с удлиненного зонда захвата.

18. Способ по п. 16 или 17, характеризующийся тем, что зонд захвата присоединен к подложке.

19. Способ по п. 18, характеризующийся тем, что подложка включает гранулу или проточную ячейку.

20. Способ по любому из пп. 16-19, характеризующийся тем, что зонд захвата содержит индекс зонда захвата.

21. Способ по любому из пп. 16-20, характеризующийся тем, что зонд захвата содержит отщепляемый линкер.

22. Способ по п. 21, включающий отщепление отщепляемого линкера.

23. Способ получения библиотеки нуклеиновых кислот, включающий:

(a) получение множества нуклеиновых кислот, причем указанное множество нуклеиновых кислот представляет собой одноцепочечные нуклеиновые кислоты;

(b) дефосфорилирование 5'-концов одноцепочечных нуклеиновых кислот;

(c) лигирование линкера с 3'-концами одноцепочечных нуклеиновых кислот, причем линкер содержит первый адаптер и второй адаптер, а 3'-конец линкера содержит блокирующую группу;

(d) фосфорилирование 5'-концов лигированных одноцепочечных нуклеиновых кислот;

(e) снятие защиты с 3'-концов фосфорилированных нуклеиновых кислот и замыкание нуклеиновых кислот со снятой защитой в кольцо путем лигирования, за счет чего получают библиотеку кольцевых нуклеиновых кислот.

24. Способ по п. 23, характеризующийся тем, что линкер содержит расщепляемый сайт между первым адаптером и вторым адаптером.

25. Способ по п. 24, дополнительно включающий перевод кольцевых нуклеиновых кислот в линейную форму путем расщепления по расщепляемому линкеру.

26. Способ по п. 24 или 25, характеризующийся тем, что расщепляемый сайт содержит остаток урацила.

27. Способ по п. 26, включающий приведение кольцевых нуклеиновых кислот в контакт с урацил-специфическим эксцизионным реагентом.

28. Способ по п. 27, характеризующийся тем, что урацил-специфический эксцизионный реагент содержит фермент, выбранный из урацил-ДНК-гликозилазы (UDG) и ДНК-гликозилазы-лиазы-эндонуклеазы VIII.

29. Способ по любому из пп. 23-28, дополнительно включающий амплификацию кольцевых нуклеиновых кислот способом, включающим гибридизацию по меньшей мере праймера с первым адаптером или вторым адаптером.

30. Способ по п. 29, характеризующийся тем, что амплификацию выбирают из ПЦР и амплификации по принципу катящегося кольца (RCA).

31. Способ по п. 29, характеризующийся тем, что амплификация включает приведение кольцевых нуклеиновых кислот в контакт с полимеразой, которая образует линейный продукт при контакте с остатком урацила в матрице.

32. Способ по любому из пп. 23-31, характеризующийся тем, что дефосфорилирование 5'-конца одноцепочечных нуклеиновых кислот включает приведение одноцепочечных нуклеиновых кислот в контакт с фосфатазой.

33. Способ по любому из пп. 1-32, характеризующийся тем, что этапы (b)-(е) выполняют в едином реакционном объеме.

34. Способ по любому из пп. 1-33, характеризующийся тем, что этапы (b)-(e) выполняют в единственном реакционном сосуде.

35. Способ по любому из пп. 1-34, характеризующийся тем, что первый адаптер и/или второй адаптер содержат сайт связывания праймера для секвенирования.

36. Способ по п. 35, характеризующийся тем, что первый адаптер содержит последовательность Р7, последовательность Р5 или их комплемент или обратный комплемент.

37. Способ по п. 35, характеризующийся тем, что второй адаптер содержит последовательность Р7, последовательность Р5 или их комплемент или обратный комплемент.

38. Способ по любому из пп. 1-37, характеризующийся тем, что первый адаптер и/или второй адаптер содержат индекс адаптера.

39. Способ по п. 38, характеризующийся тем, что индекс первого адаптера отличается от индекса второго адаптера.

40. Способ по п. 38 или 39, характеризующийся тем, что индекс адаптера указывает на источник множества нуклеиновых кислот.

41. Способ по любому из пп. 1-40, характеризующийся тем, что блокирующая группа содержит 3'-спейсер С3 или дидезоксинуклеотид.

42. Способ по любому из пп. 1-41, характеризующийся тем, что лигаза содержит лигазу одноцепочечных нуклеиновых кислот.

43. Способ по любому из пп. 1-42, характеризующийся тем, что лигирование первого адаптера и/или лигирование второго адаптера выполняют в присутствии агента, вызывающего эффект исключения объема.

44. Способ по п. 43, характеризующийся тем, что агент, вызывающий эффект исключения объема, выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), декстрана, гидроксиэтилкрахмала, фиколла и поливинилпирролидона.

45. Способ по п. 43, характеризующийся тем, что первый этап лигирования и/или второй этап лигирования выполняют в реакционном объеме, содержащем по меньшей мере приблизительно 37% (вес/об.) ПЭГ.

46. Способ по п. 43, характеризующийся тем, что первый этап лигирования и/или второй этап лигирования выполняют в реакционном объеме, содержащем по меньшей мере приблизительно 60% (вес/об.) ПЭГ.

47. Способ по любому из пп. 1-46, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот содержит РНК.

48. Способ по любому из пп. 1-46, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот содержит кДНК или геномную ДНК.

49. Способ по любому из пп. 1-48, характеризующийся тем, что средний размер нуклеиновой кислоты из множества нуклеиновых кислот составляет менее приблизительно 200 нуклеотидов.

50. Способ по любому из пп. 1-49, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот получают из низкокачественного источника нуклеиновых кислот.

51. Способ по п. 50, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот получают из фиксированного образца.

52. Способ по любому из пп. 1-51, дополнительно включающий амплификацию библиотеки нуклеиновых кислот.

53. Способ по любому из пп. 1-52, дополнительно включающий получение данных о последовательности из библиотеки нуклеиновых кислот.

54. Библиотека нуклеиновых кислот, полученная способом по любому из пп. 1-53.

55. Набор, включающий:

первый адаптер, причем 3'-конец указанного первого адаптера содержит блокирующую группу, причем указанный первый адаптер содержит последовательность Р7, последовательность Р5 или их комплемент или обратный комплемент;

лигазу; и

компонент, выбранный из группы, состоящей из агента, вызывающего эффект исключения объема, киназы, фосфатазы, 5'-фосфат-зависимой экзонуклеазы, 5'-деаденилазы, полимеразы, образующей линейный продукт при контакте с остатком урацила в матрице, урацил-специфического эксцизионного реагента, и второй адаптер, причем указанный второй адаптер содержит последовательность Р7, последовательность Р5 или их комплемент или обратный комплемент.

56. Набор по п. 55, характеризующийся тем, что линкер содержит первый и второй адаптеры.

57. Реакционный сосуд, содержащий реакционный объем, содержащий:

множество нуклеиновых кислот;

первый адаптер, причем 3'-конец первого адаптера содержит блокирующую группу;

лигазу; и

агент, вызывающий эффект исключения объема.

58. Реакционный сосуд по п. 57, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот представляет собой одноцепочечные нуклеиновые кислоты.

59. Реакционный сосуд по п. 58, характеризующийся тем, что первый адаптер лигирован с 3'-концами множества одноцепочечных нуклеиновых кислот, за счет чего образуется множество модифицированных одноцепочечных нуклеиновых кислот.

60. Реакционный сосуд по п. 59, характеризующийся тем, что нелигированный первый адаптер гибридизован с зондом захвата.

61. Реакционный сосуд по п. 60, характеризующийся тем, что зонд захвата содержит последовательность, комплементарную по меньшей мере части первого адаптера.

62. Реакционный сосуд по п. 57, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот представляет собой двуцепочечные нуклеиновые кислоты, содержащие 3'-выступающие концы.

63. Реакционный сосуд по п. 62, характеризующийся тем, что первый адаптер лигирован с 3'-концами множества двуцепочечных нуклеиновых кислот, содержащих 3'-выступающие концы, за счет чего образуется множество модифицированных двуцепочечных нуклеиновых кислот.

64. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-63, дополнительно содержащий второй адаптер.

65. Реакционный сосуд по п. 64, характеризующийся тем, что 5'-конец второго адаптера нефосфорилирован.

66. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-65, содержащий дефосфорилирующий агент.

67. Реакционный сосуд по п. 66, характеризующийся тем, что дефосфорилирующий агент содержит фосфатазу.

68. Реакционный сосуд по п. 67, характеризующийся тем, что фосфатаза является инактивированной.

69. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-68, характеризующийся тем, что агент, вызывающий эффект исключения объема, выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), декстрана, гидроксиэтилкрахмала, фиколла и поливинилпирролидона.

70. Реакционный сосуд по п. 69, характеризующийся тем, что указанный реакционный объем содержит по меньшей мере приблизительно 37% (вес/об.) ПЭГ.

71. Реакционный сосуд по п. 69, характеризующийся тем, что указанный реакционный объем содержит по меньшей мере приблизительно 60% (вес/об.) ПЭГ.

72. Реакционный сосуд по любому из пп. 64-71, характеризующийся тем, что первый адаптер и/или второй адаптер содержат сайт связывания праймера для секвенирования.

73. Реакционный сосуд по любому из пп. 64-72, характеризующийся тем, что первый адаптер и/или второй адаптер содержат индекс адаптера.

74. Реакционный сосуд по п. 73, характеризующийся тем, что индекс первого адаптера отличается от индекса второго адаптера.

75. Реакционный сосуд по п. 73, характеризующийся тем, что индекс адаптера указывает на источник множества одноцепочечных нуклеиновых кислот.

76. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-75, характеризующийся тем, что блокирующая группа содержит 3'-спейсер С3 или дидезоксинуклеотид.

77. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-76, характеризующийся тем, что блокирующая группа содержит 3'-спейсер С3.

78. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-77, характеризующийся тем, что лигаза содержит лигазу одноцепочечных нуклеиновых кислот.

79. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-78, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот содержит РНК.

80. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-78, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот содержит кДНК или геномную ДНК.

81. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-80, характеризующийся тем, что множество одноцепочечных нуклеиновых кислот получают из низкокачественного источника нуклеиновых кислот.

82. Реакционный сосуд по п. 81, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот получено из фиксированного образца.

83. Проточная ячейка, содержащая реакционный сосуд по любому из пп. 57-82.

84. Система, содержащая реакционный сосуд по любому из пп. 57-82, и детектор для получения данных секвенирования.