Мультиплексная амплификация нуклеиновых кислот с введением концевых меток - RU2019142713A
Код документа: RU2019142713A
Формула
1. Способ амплификации ДНК, включающий
контактирование геномной ДНК с библиотекой транспосом, где каждая транспосома библиотеки, имеет две транспозазы и две транспозонные ДНК, в которой каждая транспозонная ДНК включает сайт связывания транспозазы и последовательность сайта связывания праймера, последовательность сайта связывания праймера, отличающуюся от сайта связывания праймера других членов библиотеки транспосом,
в котором библиотека транспосом связывается с целевыми местоположениями вдоль геномной ДНК, и транспозаза расщепляет геномную ДНК на множество двухцепочечных фрагментов геномной ДНК, представляющих библиотеку фрагментов геномной ДНК, где каждый двухцепочечный фрагмент геномной ДНК включает уникальную и/или отличающуюся последовательность сайта связывания праймера на каждом конце фрагмента геномной ДНК,
заполнение пробела между транспозонной ДНК и фрагментом геномной ДНК с образованием библиотеки продуктов удлинения фрагментов двухцепочечной геномной ДНК, имеющих уникальные и/или отличающиеся последовательности сайтов связывания праймеров на каждом конце, и
амплификацию продуктов удлинения двухцепочечных фрагментов геномной ДНК для получения ампликонов.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий секвенирование ампликонов.
3. Способ по п. 1, в котором каждая транспосома в библиотеке транспосом включает две отличающиеся последовательности сайта связывания праймеров.
4. Способ по п. 1, в котором каждая транспосома в библиотеке транспосом включает две идентичные последовательности сайта связывания праймеров в каждом транспозоне транспосомы, которые отличаются от последовательностей сайтов связывания праймеров других транспосом из данной библиотеки транспосом.
5. Способ по п. 1, в котором геномная ДНК представляет собой полную геномную ДНК, полученную из одиночной клетки.
6. Способ по п. 1, в котором транспозаза представляет собой транспозазу Tn5, транспозазу Mu, транспозазу Tn7 или транспозазу IS5.
7. Способ по п. 1, в котором ДНК транспозона включает двухцепочечный сайт связывания Tnp, размером 19 п.о., и выступ, при этом выступ включает уникальную и/или отличающуюся последовательность сайта связывания праймера на 5'-конце выступа.
8. Способ по п. 1, в котором связанные транспозазы удаляют из двухцепочечных фрагментов перед заполнением пробела и удлинением двухцепочечных фрагментов геномной ДНК.
9. Способ по п. 1, в котором геномную ДНК получают из пренатальной клетки.
10. Способ по п. 1, в котором геномную ДНК получают из раковой клетки.
11. Способ по п. 1, в котором геномную ДНК получают из циркулирующей в крови опухолевой клетки.
12. Способ по п. 1, в котором геномную ДНК получают из одиночной пренатальной клетки.
13. Способ по п. 1, в котором геномную ДНК получают из одиночной раковой клетки.
14. Способ по п. 1, в котором геномную ДНК получают из циркулирующей в крови одиночной опухолевой клетки.
15. Способ по п. 1, в котором геномная ДНК представляет собой продукт захвата конформации хроматина из одиночной клетки или небольшого образца.
16. Способ по п. 1, в котором геномная ДНК представляет собой нативный или фиксированный хроматин из одиночной клетки или незначительного количества образцов.
17. Способ по п. 1, в котором уникальная и отличающаяся последовательность сайта связывания праймера представляет собой специфический сайт связывания ПЦР-праймера.
18. Способ по п. 1, в котором библиотека транспосом включает от 1 до 100 уникальных и отличающихся последовательностей сайта связывания праймера.
19. Способ по п. 1, в котором библиотека транспосом включает от 1 до 10 уникальных и отличающихся последовательностей сайта связывания праймера.
20. Способ по п. 1, в котором библиотека транспосом включает от 5 до 50 уникальных и отличающихся последовательностей сайта связывания праймера.
21. Способ по п. 1, в котором библиотека транспосом включает от 30 до 100 уникальных и отличающихся последовательностей сайта связывания праймера.
22. Способ по п. 1, в котором библиотека транспосом включает от 15 до 25 уникальных и отличающихся последовательностей сайта связывания праймера.
23. Способ по п. 1, в котором библиотека транспосом включает от 100 до 1000 уникальных и отличающихся последовательностей сайта связывания праймера.
24. Способ по п. 1, в котором библиотека транспосом включает от 1000 до 10000 уникальных и отличающихся последовательностей сайта связывания праймера.
25. Способ по п. 1, в котором библиотека транспосом включает от 10000 до 100000 уникальных и отличающихся последовательностей сайта связывания праймера.
26. Способ по п. 1, в котором различные последовательности сайтов связывания праймеров ортогональны.
27. Способ создания ампликонов двухцепочечной ДНК, имеющих уникальные и/или отличающиеся последовательности сайтов праймирования на каждом конце, включающий
разделение целевой двухцепочечной ДНК, имеющей последовательность связывания с транспозазой и одинаковую последовательность сайта праймирования на каждом конце, на первую одинарную цепь и вторую цепь,
гибридизацию с первой цепью первого праймера, имеющего первую последовательность, комплементарную сайту связывания транспозазы, и вторую последовательность, не комплементарную последовательности сайта праймирования,
гибридизацию со второй цепью второго праймера, имеющего первую последовательность, комплементарную сайту связывания транспозазы, и вторую последовательность, комплементарную последовательности сайта праймирования,
удлинение первого праймера вдоль первой цепи и удлинение второго праймера вдоль второй цепи и
амплификацию продуктов удлинения для получения двухцепочечных ампликонов ДНК, имеющих уникальные и/или отличающиеся последовательности сайтов праймирования на каждом конце.
28. Способ амплификации двух цепей последовательности двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей разные сайты праймирования на каждом конце, включающий
разделение двухцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты на первую цепь и вторую цепь,
амплификацию первой цепи в отсутствие второй цепи для создания ампликонов первой цепи,
амплификацию второй цепи в отсутствие первой цепи для создания ампликонов второй цепи,
секвенирование ампликонов первой цепи и
секвенирование ампликонов второй цепи.
29. Способ по п. 28, дополнительно включающий
отжиг 3'-конца первой цепи и второй цепи с праймерами, содержащими праймирующую область, которая комплементарна 3'-концу первой цепи и второй цепи, и первую адаптерную последовательность, синтезирующую комплементарные цепи ДНК-полимеразой, удаление избытка праймеров экзонуклеазой,
отжиг 3'-конца синтезированных комплементарных цепей первой цепи и второй цепи с праймерами, содержащими праймирующую область, которая комплементарна 3'-концу первой цепи и второй цепи, и вторую последовательность адаптера, синтезирующую комплементарные цепи ДНК-полимеразой, удаление избытка праймеров экзонуклеазой,
амплификацию целевых последовательностей с помощью ПЦР с праймерами, которые отжигают с первой последовательностью адаптера и второй последовательностью адаптера, чтобы создать ампликоны для первой цепи и второй цепи,
секвенирование ампликонов, чтобы отличить первую цепь от второй цепи,
при этом первый конец первой цепи помечен первым адаптером, а второй конец первой цепи помечен вторым адаптером,
при этом первый конец второй цепи помечен вторым адаптером, второй конец второй цепи помечен первым адаптером.
30. Способ по п. 15, в котором определение конформации хроматина происходит из диплоидного образца, и определяют информацию о гаплотипе каждого определенного контакта хроматина.
