Полногеномные библиотеки отдельных клеток для бисульфитного секвенирования - RU2019144026A
Код документа: RU2019144026A
Формула
1. Способ получения библиотеки для секвенирования для определения статуса метилирования нуклеиновых кислот из совокупности отдельных клеток, включающий:
(a) получение выделенных ядер из совокупности клеток;
(b) химическую обработку выделенных ядер с получением обедненных нуклеосомами ядер при сохранении целостности выделенных ядер;
(c) распределение субпопуляций обедненных нуклеосомами ядер в первую совокупность компартментов, содержащих транспосомный комплекс, где транспосомный комплекс в каждом компартменте содержит первую индексную последовательность, которая отличается от первых индексных последовательностей в других компартментах;
(d) фрагментирование нуклеиновых кислот в субпопуляциях обедненных нуклеосомами ядер с получением совокупности фрагментов нуклеиновых кислот и встраивание первых индексных последовательностей в по меньшей мере одну нить фрагментов нуклеиновых кислот с получением индексированных ядер;
(e) объединение индексированных ядер с получением объединенных в пул индексированных ядер;
(f) распределение субпопуляций объединенных в пул индексированных ядер во вторую совокупность компартментов и обработку бисульфитом индексированных ядер с получением обработанных бисульфитом фрагментов нуклеиновых кислот;
(g) амплификацию обработанных бисульфитом фрагментов нуклеиновых кислот в каждом компартменте посредством линейной амплификации с использованием совокупности праймеров, содержащих универсальную нуклеотидную последовательность на 5'-конце и случайную нуклеотидную последовательность на 3'-конце, с получением амплифицированных молекул фрагмент-адаптер;
(h) встраивание второй индексной последовательности в амплифицированные молекулы фрагмент-адаптер с получением молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом, где вторая индексная последовательность в каждом компартменте отличается от вторых индексных последовательностей в других компартментах; и
(i) объединение молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом с получением тем самым библиотеки для секвенирования для определения статуса метилирования нуклеиновых кислот из совокупности отдельных клеток.
2. Способ по п. 1, в котором химическая обработка включает обработку хаотропным средством, способным нарушать взаимодействия нуклеиновых кислот с белками.
3. Способ по п. 2, в котором хаотропное средство содержит дийодсалицилат лития.
4. Способ по п. 1, в котором химическая обработка включает обработку детергентом, способным нарушать взаимодействия нуклеиновых кислот с белками.
5. Способ по п. 4, в котором детергент включает додецилсульфат натрия (SDS).
6. Способ по п. 5, в котором клетки перед стадией (а) обрабатывают сшивающим средством.
7. Способ по п. 6, в котором сшивающее средство представляет собой формальдегид.
8. Способ по п. 1, в котором распределение на стадиях (с) и (f) осуществляют путем сортировки ядер с активированной флуоресценцией.
9. Способ по п. 1, в котором субпопуляции обедненных нуклеосомами ядер содержат примерно равные количества ядер.
10. Способ по п. 9, в котором субпопуляции обедненных нуклеосомами ядер содержат от 1 до приблизительно 2000 ядер.
11. Способ по п. 1, в котором первая совокупность компартментов представляет собой многолуночный планшет.
12. Способ по п. 11, в котором многолуночный планшет представляет собой 96-луночный планшет или 384-луночный планшет.
13. Способ по п. 1, в котором субпопуляции объединенных в пул индексированных ядер содержат примерно равные количества ядер.
14. Способ по п. 13, в котором субпопуляции объединенных в пул индексированных ядер содержат от 1 до приблизительно 25 ядер.
15. Способ по п. 1, в котором субпопуляции объединенных в пул индексированных ядер включают в по меньшей мере 10 раз меньшее количество ядер, чем субпопуляции обедненных нуклеосомами ядер.
16. Способ по п. 1, в котором субпопуляции объединенных в пул индексированных ядер включают в по меньшей мере 100 раз меньшее количество ядер, чем субпопуляции обедненных нуклеосомами ядер.
17. Способ по п. 1, в котором вторая совокупность компартментов представляет собой многолуночный планшет.
18. Способ по п. 17, в котором многолуночный планшет представляет собой 96-луночный планшет или 384-луночный планшет.
19. Способ по п. 1, в котором каждый из транспосомных комплексов содержит транспозазы и транспозоны, при этом каждый из транспозонов содержит перенесенную нить.
20. Способ по п. 19, в котором перенесенная нить не содержит остатка цитозина.
21. Способ по п. 20, в котором перенесенная нить содержит первую индексную последовательность.
22. Способ по п. 21, в котором перенесенная нить дополнительно содержит первую универсальную последовательность и первую последовательность праймера для секвенирования.
23. Способ по п. 1, в котором обработка бисульфитом превращает неметилированные остатки цитозина динуклеотидов CpG в остатки урацила и оставляет неизмененными остатки 5-метилцитозина.
24. Способ по п. 1, в котором линейная амплификация обработанных бисульфитом фрагментов нуклеиновых кислот предусматривает от 1 до 10 циклов.
25. Способ по п. 1, в котором универсальная нуклеотидная последовательность на 5'-конце праймеров на стадии (g) содержит вторую последовательность праймера для секвенирования.
26. Способ по п. 1, в котором случайная нуклеотидная последовательность на 3'-конце праймеров на стадии (g) состоит из 9 случайных нуклеотидов.
27. Способ по п. 1, в котором встраивание второй индексной последовательности на стадии (h) предусматривает приведение амплифицированных молекул фрагмент-адаптер в каждом компартменте в контакт с первым универсальным праймером и вторым универсальным праймером, каждый из которых содержит индексную последовательность, и осуществление реакции экспоненциальной амплификации.
28. Способ по п. 27, в котором индексная последовательность первого универсального праймера представляет собой последовательность, обратно комплементарную индексной последовательности второго универсального праймера.
29. Способ по п. 27, в котором индексная последовательность первого универсального праймера отличается от последовательности, обратно комплементарной индексной последовательности второго универсального праймера.
30. Способ по п. 27, в котором первый универсальный праймер дополнительно содержит первую последовательность для захвата и первую якорную последовательность, комплементарную универсальной последовательности на 3'-конце амплифицированных молекул фрагмент-адаптер.
31. Способ по п. 30, в котором первая последовательность для захвата содержит последовательность праймера P5.
32. Способ по п. 27, в котором второй универсальный праймер дополнительно содержит вторую последовательность для захвата и вторую якорную последовательность, комплементарную универсальной последовательности на 5'-конце амплифицированных молекул фрагмент-адаптер.
33. Способ по п. 32, в котором вторая последовательность для захвата содержит последовательность, обратно комплементарную последовательности праймера P7.
34. Способ по п. 27, в котором реакция экспоненциальной амплификации включает полимеразную цепную реакцию (ПЦР).
35. Способ по п. 34, в котором ПЦР включает от 15 до 30 циклов.
36. Способ по п. 1, дополнительно включающий обогащение нуклеиновых кислот-мишеней с помощью совокупности олигонуклеотидов для захвата, характеризующихся специфичностью по отношению к нуклеиновым кислотам-мишеням.
37. Способ по п. 36, в котором олигонуклеотиды для захвата иммобилизованы на поверхности твердого субстрата.
38. Способ по п. 36, в котором олигонуклеотиды для захвата содержат первый член универсальной пары связывания, и где второй член пары связывания иммобилизован на поверхности твердого субстрата.
39. Способ по п. 1, дополнительно включающий отбор молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом, которые попадают в заранее определенный диапазон размеров.
40. Способ по п. 1, дополнительно включающий секвенирование молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом для определения статуса метилирования нуклеиновых кислот из совокупности отдельных клеток.
41. Способ получения библиотеки для секвенирования для определения статуса метилирования нуклеиновых кислот из совокупности отдельных клеток, включающий:
(a) получение выделенных ядер из совокупности клеток;
(b) химическую обработку выделенных ядер с получением обедненных нуклеосомами ядер при сохранении целостности выделенных ядер;
(c) распределение субпопуляций обедненных нуклеосомами ядер в первую совокупность компартментов, содержащих транспосомный комплекс, где транспосомный комплекс в каждом компартменте содержит первую индексную последовательность, которая отличается от первых индексных последовательностей в других компартментах;
(d) фрагментирование нуклеиновых кислот в субпопуляциях обедненных нуклеосомами ядер с получением совокупности фрагментов нуклеиновых кислот и встраивание первых индексных последовательностей в по меньшей мере одну нить фрагментов нуклеиновых кислот с получением индексированных ядер;
(e) объединение индексированных ядер с получением объединенных в пул индексированных ядер;
(f) распределение субпопуляций объединенных в пул индексированных ядер во вторую совокупность компартментов и обработку бисульфитом индексированных ядер с получением обработанных бисульфитом фрагментов нуклеиновых кислот;
(g) лигирование обработанных бисульфитом фрагментов нуклеиновых кислот в каждом компартменте с универсальным адаптером с получением лигированных молекул фрагмент-адаптер;
(h) встраивание второй индексной последовательности в лигированные молекулы фрагмент-адаптер с получением молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом, где вторая индексная последовательность в каждом компартменте отличается от вторых индексных последовательностей в других компартментах; и
(i) объединение молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом с получением тем самым библиотеки для секвенирования для определения статуса метилирования нуклеиновых кислот из совокупности отдельных клеток.
42. Способ по п. 41, в котором химическая обработка включает обработку хаотропным средством, способным нарушать взаимодействия нуклеиновых кислот с белками.
43. Способ по п. 42, в котором хаотропное средство содержит дийодсалицилат лития.
44. Способ по п. 41, в котором химическая обработка включает обработку детергентом, способным нарушать взаимодействия нуклеиновых кислот с белками.
45. Способ по п. 44, в котором детергент включает додецилсульфат натрия (SDS).
46. Способ по п. 45, в котором клетки перед стадией (а) обрабатывают сшивающим средством.
47. Способ по п. 46, в котором сшивающее средство представляет собой формальдегид.
48. Способ по п. 41, в котором распределение на стадиях (с) и (f) осуществляют путем сортировки ядер с активированной флуоресценцией.
49. Способ по п. 41, в котором субпопуляции обедненных нуклеосомами ядер содержат примерно равные количества ядер.
50. Способ по п. 49, в котором субпопуляции обедненных нуклеосомами ядер содержат от 1 до приблизительно 2000 ядер.
51. Способ по п. 41, в котором первая совокупность компартментов представляет собой многолуночный планшет.
52. Способ по п. 51, в котором многолуночный планшет представляет собой 96-луночный планшет или 384-луночный планшет.
53. Способ по п. 41, в котором субпопуляции объединенных в пул индексированных ядер содержат примерно равные количества ядер.
54. Способ по п. 53, в котором субпопуляции объединенных в пул индексированных ядер содержат от 1 до приблизительно 25 ядер.
55. Способ по п. 41, в котором субпопуляции объединенных в пул индексированных ядер включают в по меньшей мере 10 раз меньшее количество ядер, чем субпопуляции обедненных нуклеосомами ядер.
56. Способ по п. 41, в котором субпопуляции объединенных в пул индексированных ядер включают в по меньшей мере 100 раз меньшее количество ядер, чем субпопуляции обедненных нуклеосомами ядер.
57. Способ по п. 41, в котором вторая совокупность компартментов представляет собой многолуночный планшет.
58. Способ по п. 57, в котором многолуночный планшет представляет собой 96-луночный планшет или 384-луночный планшет.
59. Способ по п. 41, в котором каждый из транспосомных комплексов содержит транспозазы и транспозоны, при этом каждый из транспозонов содержит перенесенную нить.
60. Способ по п. 59, в котором перенесенная нить не содержит остатка цитозина.
61. Способ по п. 60, в котором перенесенная нить содержит первую индексную последовательность.
62. Способ по п. 61, в котором перенесенная нить дополнительно содержит первую универсальную последовательность и первую последовательность праймера для секвенирования.
63. Способ по п. 41, в котором обработка бисульфитом превращает неметилированные остатки цитозина динуклеотидов CpG в остатки урацила и оставляет неизмененными остатки 5-метилцитозина.
64. Способ по п. 41, дополнительно включающий добавление одного или нескольких нуклеотидов к 3'-концам обработанных бисульфитом фрагментов нуклеиновых кислот для создания 3'-"липкого" конца перед лигированием универсального адаптера.
65. Способ по п. 64, в котором добавление одного или нескольких нуклеотидов осуществляют с использованием концевой трансферазы.
66. Способ по п. 64, в котором универсальный адаптер содержит "липкий" конец, который является обратно комплементарным 3'-"липкому" концу обработанных бисульфитом фрагментов нуклеиновых кислот.
67. Способ по п. 41, в котором встраивание второй индексной последовательности на стадии (h) включает приведение молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом в каждом компартменте в контакт с первым универсальным праймером и вторым универсальным праймером, каждый из которых содержит индексную последовательность, и осуществление реакции экспоненциальной амплификации.
68. Способ по п. 67, в котором индексная последовательность первого универсального праймера представляет собой последовательность, обратно комплементарную индексной последовательности второго универсального праймера.
69. Способ по п. 67, в котором индексная последовательность первого универсального праймера отличается от последовательности, обратно комплементарной индексной последовательности второго универсального праймера.
70. Способ по п. 67, в котором первый универсальный праймер дополнительно содержит первую последовательность для захвата и первую якорную последовательность, комплементарную универсальной последовательности на 3'-конце молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом.
71. Способ по п. 70, в котором первая последовательность для захвата содержит последовательность праймера P5.
72. Способ по п. 67, в котором второй универсальный праймер дополнительно содержит вторую последовательность для захвата и вторую якорную последовательность, комплементарную универсальной последовательности на 5'-конце молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом.
73. Способ по п. 72, в котором вторая последовательность для захвата содержит последовательность, обратно комплементарную последовательности праймера P7.
74. Способ по п. 67, в котором реакция экспоненциальной амплификации включает полимеразную цепную реакцию (ПЦР).
75. Способ по п. 74, в котором ПЦР включает от 15 до 30 циклов.
76. Способ по п. 41, дополнительно включающий обогащение нуклеиновых кислот-мишеней с помощью совокупности олигонуклеотидов для захвата, характеризующихся специфичностью по отношению к нуклеиновым кислотам-мишеням.
77. Способ по п. 76, в котором олигонуклеотиды для захвата иммобилизованы на поверхности твердого субстрата.
78. Способ по п. 76, в котором олигонуклеотиды для захвата содержат первый член универсальной пары связывания, и где второй член пары связывания иммобилизован на поверхности твердого субстрата.
79. Способ по п. 41, дополнительно включающий отбор молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом, которые попадают в заранее определенный диапазон размеров.
80. Способ по п. 41, дополнительно включающий секвенирование молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом для определения статуса метилирования нуклеиновых кислот из совокупности отдельных клеток.
81. Способ по п. 40, дополнительно включающий:
получение поверхности, содержащей совокупность сайтов амплификации,
где сайты амплификации содержат по меньшей мере две популяции присоединенных однонитевых нуклеиновых кислот, имеющих свободный 3'-конец, и
приведение в контакт поверхности, содержащей сайты амплификации, с библиотекой для секвенирования в условиях, подходящих для получения совокупности сайтов амплификации, каждый из которых содержит клональную популяцию ампликонов из отдельной молекулы фрагмент-адаптер с двойным индексом.
82. Способ по п. 81, в котором количество молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом превышает количество сайтов амплификации, где молекулы фрагмент-адаптер с двойным индексом имеют доступ посредством текучей среды к сайтам амплификации и где каждый из сайтов амплификации характеризуется емкостью, соответствующей нескольким молекулам фрагмент-адаптер с двойным индексом в библиотеке для секвенирования.
83. Способ по п. 81, в котором приведение в контакт включает одновременно (i) транспортировку молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом к сайтам амплификации со средней скоростью транспортировки и (ii) амплификацию молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом, которые находятся в сайтах амплификации, со средней скоростью амплификации, где средняя скорость амплификации превышает среднюю скорость транспортировки.
84. Способ по п. 80, дополнительно включающий:
получение поверхности, содержащей совокупность сайтов амплификации,
где сайты амплификации содержат по меньшей мере две популяции присоединенных однонитевых нуклеиновых кислот, имеющих свободный 3'-конец, и
приведение в контакт поверхности, содержащей сайты амплификации, с библиотекой для секвенирования в условиях, подходящих для получения совокупности сайтов амплификации, каждый из которых содержит клональную популяцию ампликонов из отдельной молекулы фрагмент-адаптер с двойным индексом.
85. Способ по п. 84, в котором количество молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом превышает количество сайтов амплификации, где молекулы фрагмент-адаптер с двойным индексом имеют доступ посредством текучей среды к сайтам амплификации и где каждый из сайтов амплификации характеризуется емкостью, соответствующей нескольким молекулам фрагмент-адаптер с двойным индексом в библиотеке для секвенирования.
86. Способ по п. 84, в котором приведение в контакт включает одновременно (i) транспортировку молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом к сайтам амплификации со средней скоростью транспортировки и (ii) амплификацию молекул фрагмент-адаптер с двойным индексом, которые находятся в сайтах амплификации, со средней скоростью амплификации, где средняя скорость амплификации превышает среднюю скорость транспортировки.
