Способы de novo сборки баркодированных фрагментов геномной днк - RU2019106038A

1. Способ создания библиотеки транспозом, включающий

прикрепление множества ДНК транспозона к каждой из множества микрочастиц, причем все ДНК транспозона, присоединенные к одной микрочастице, включают общую уникальную баркод-последовательность, ассоциированную с одной микрочастицей, так что каждая микрочастица из множества имеет уникальную последовательность, связанную с баркодом,

объединение множества микрочастиц с присоединенной к ним ДНК транспозона с транспозазой и ферментом расщепления с образованием водной смеси,

объединение водной смеси с масляной фазой так, чтобы образовалось множество микрокапель, причем каждая микрочастица из множества изолируется внутри соответствующей отдельной микрокапли вместе с транспозазой и ферментом расщепления,

для каждой соответствующей отдельной микрокапли, отщепление множества ДНК транспозона от микрочастицы внутри соответствующей отдельной микрокапли и формирование множества транспозом внутри микрокапли, где каждая транспозома в микрокапле содержит две ДНК транспозона с общей уникальной баркод-последовательностью,

лизис каждой микрокапли из множества микрокапель и

сбор транспозом для создания библиотеки транспозом.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что библиотека транспозом включает более чем 1000 транспозом.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что библиотека транспозом включает более чем 10000 транспосзом.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что библиотека транспозом включает более чем 100000 транспозом.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что библиотека транспозом включает более чем 1000000 транспозом.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что библиотека транспозом включает более чем 2000000 транспозом.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что библиотека транспозом включает более чем 3000000 транспозом.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что библиотека транспозом включает более чем 4000000 транспозом.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что библиотека транспозом включает более чем 5000000 транспозом.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что библиотека транспозом включает более чем 10000000 транспозом.

11. Способ по п. 1, дополнительно включающий взятие части библиотеки транспозом для формирования библиотеки реагентов транспозом, где каждая транспозома библиотеки реагентов транспозом имеет уникальную ассоциированную баркод-последовательность.

12. Способ по п. 1, дополнительно включающий взятие части библиотеки транспозом для формирования библиотеки реагентов транспозом, где по существу все транспозомы в библиотеке реагентов транспозом имеют уникальную ассоциированную баркод-последовательность.

13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что каждая ДНК транспозона включает специфический сайт связывания праймера и двухцепочечный сайт связывания транспозазы.

14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ДНК транспозона включает двухцепочечный сайт связывания транспозазы и выступ, при этом выступ включает баркод-последовательность и сайт связывания праймера на 5'-конце выступа.

15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что каждая ДНК транспозона присоединяется к соответствующей микрочастице с помощью линкера и сайта расщепления.

16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что каждая ДНК транспозона включает 5'-выступ и присоединяется на соответствующем 5'-конце к соответствующей микрочастице с помощью линкера и сайта расщепления.

17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что транспозазой является транспозаза Tn5, транспозаза Mu, транспозаза Tn7 или транспозаза IS5.

18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что масляная фаза включает поверхностно-активное вещество.

19. Способ по п. 1, отличающийся тем, что множество микрокапель в масляной фазе создают путем объединения водной смеси с масляной фазой таким образом, чтобы создать больше микрокапель, чем имеется микрочастиц.

20. Способ по п. 1, отличающийся тем, что множество микрокапель в масляной фазе создают путем объединения водной смеси с масляной фазой таким образом, чтобы создать больше микрокапель, чем имеется микрочастиц, и где множество микрокапель создается самопроизвольно.

21. Способ по п. 1, отличающийся тем, что множество микрокапель в масляной фазе создают путем объединения масляной фазы и водной среды в микрожидкостном чипе.

22. Способ по п. 1, отличающийся тем, что множество микрокапель лизируют деэмульгирующим агентом.

23. Способ сборки геномной ДНК de novo, включающий

контакт геномной ДНК с библиотекой транспозом, где каждая транспозома библиотеки имеет свою собственную уникальную ассоциированную баркод-последовательность, где каждая транспозома библиотеки включает транспозазу и гомодимер ДНК транспозона, где каждая ДНК транспозона гомодимера включает сайт связывания с транспозазой, уникальную баркод-последовательность и сайт связывания праймера, где библиотека транспозом связывается с точками-мишенями вдоль геномной ДНК, а транспозаза расщепляет геномную ДНК на множество двухцепочечных фрагментов геномной ДНК, представляющее библиотеку фрагментов геномной ДНК, причем каждый фрагмент двухцепочечной геномной ДНК включает по одному элементу уникальной пары баркод-последовательностей на каждом из концов фрагмента геномной ДНК,

заполнение гэпа между ДНК транспозона и фрагментом геномной ДНК с образованием библиотеки продуктов достройки двухцепочечных фрагментов геномной ДНК, имеющих сайты связывания праймеров на каждом из концов,

амплификация продуктов достройки двухцепочечных фрагментов геномной ДНК с получением ампликонов,

секвенирование ампликонов и

с помощью вычислительного устройства связывание ампликонов друг с другом путем сопоставления баркодов для сборки геномной ДНК de novo.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что геномная ДНК представляет собой цельную геномную ДНК, полученную из одиночной клетки.

25. Способ по п. 23, отличающийся тем, что транспозазой является транспозаза Tn5, транспозаза Mu, транспозаза Tn7 или транспозаза IS5.

26. Способ по п. 23, отличающийся тем, что ДНК транспозона включает двухцепочечный сайт связывани Tnp длиной 19 п.о. и выступ, который включает баркод-последовательность и сайт связывания праймера на 5'-конце выступа.

27. Способ по п. 23, отличающийся тем, что связанные транспозазы удаляют из двухцепочечных фрагментов перед заполнением гэпа и достройкой двухцепочечных фрагментов геномной ДНК.

28. Способ по п. 23, отличающийся тем, что транспозазы представляют собой транспозазы Tn5, каждая из которых находится в комплексе с ДНК транспозона, где ДНК транспозона включает двухцепочечный сайт связывания Tnp длиной 19 п.о. и выступ, который включает баркод-последовательность и сайт связывания праймера.

29. Способ по п. 23, отличающийся тем, что геномная ДНК происходит из пренатальной клетки.

30. Способ по п. 23, отличающийся тем, что геномная ДНК получена из злокачественной опухолевой клетки.

31. Способ по п. 23, отличающийся тем, что геномная ДНК происходит из циркулирующей злокачественной опухолевой клетки.

32. Способ по п. 23, отличающийся тем, что геномная ДНК происходит из одной пренатальной клетки.

33. Способ по п. 23, отличающийся тем, что геномная ДНК происходит из одной злокачественной опухолевой клетки.

34. Способ по п. 23, отличающийся тем, что геномная ДНК происходит из одной циркулирующей злокачественной опухолевой клетки.

35. Способ по п. 23, отличающийся тем, что сайт связывания праймера представляет собой специфический сайт связывания ПЦР-праймера.

36. Способ по п. 23, отличающийся тем, что сборка de novo представляет собой сборку de novo с разделением по гаплотипу.

37. Способ сборки геномной ДНК de novo, включающий

создание множества водных микрокапель в неводной фазе, где каждая микрокапля включает множество транспозом, образованных в микрокапле, причем все транспозомы имеют две транспозазы и две идентичные ДНК транспозона, причем каждая ДНК транспозона имеет сайт связывания с транспозазой, баркод-последовательность и сайт связывания праймера,

высвобождение множества транспозом из каждой микрокапли и сбор освобожденных транспозом в библиотеку транспозом,

формирование библиотеки реагентов транспозом в реакционном объеме, где по существу все или все транспозомы внутри библиотеки реагентнов транспозом имеют уникальную ассоциированную баркод-последовательность,

контакт геномной ДНК с библиотекой реагентов транспозом в реакционном объеме, где транспозомы связываются с точками-мишенями вдоль геномной ДНК, а транспозаза расщепляет геномную ДНК на множество двухцепочечных фрагментов геномной ДНК, представляющих библиотеку фрагментов геномной ДНК, причем каждый двухцепочечный фрагмент геномной ДНК включает по одному элементу уникальной пары баркод-последовательностей на каждом из концов фрагмента геномной ДНК,

заполнение гэпа между ДНК транспозона и фрагментом геномной ДНК с образованием библиотеки продуктов достройки фрагмента двухцепочечной геномной ДНК, имеющих сайты связывания праймера на каждом из концов в реакционном объеме,

амплификация продуктов достройки двухцепочечных фрагментов геномной ДНК с получением ампликонов в реакционном объеме,

секвенирование ампликонов в реакционном объеме, и

с помощью вычислительного устройства связывание ампликонов друг с другом путем сопоставления баркодов для сборки геномной ДНК de novo.

38. Способ по п. 37, отличающийся тем, что библиотека реагентов транспозом включает более чем 1000 транспозом.

39. Способ по п. 37, отличающийся тем, что библиотека реагентов транспозом включает более чем 10000 транспозом.

40. Способ по п. 37, отличающийся тем, что библиотека реагентов транспозом включает более чем 100000 транспозом.

41. Способ по п. 37, отличающийся тем, что библиотека реагентов транспозом включает более чем 1000000 транспозом.

42. Способ по п. 37, отличающийся тем, что библиотека реагентов для транспозом включает более чем 2000000 транспозом.

43. Способ по п. 37, отличающийся тем, что библиотека реагентов транспозом включает более чем 3000000 транспозом.

44. Способ по п. 37, отличающийся тем, что библиотека реагентов транспозом включает более чем 4000000 транспозом.

45. Способ по п. 37, отличающийся тем, что библиотека реагентов транспозом включает более чем 5000000 транспозом.

46. Способ по п. 37, отличающийся тем, что библиотека реагентов транспозом включает более чем 10000000 транспозом.

47. Способ по п. 37, отличающийся тем, что геномная ДНК представляет собой цельную геномную ДНК, полученную из одиночной клетки.

48. Способ по п. 37, отличающийся тем, что транспозазой является транспозаза Tn5, транспозаза Mu, транспозаза Tn7 или транспозаза IS5.

49. Способ по п. 37, отличающийся тем, что ДНК транспозона включает двухцепочечный сайт связывани Tnp длиной 19 п.о. и выступ, который включает баркод-последовательность и сайт связывани праймера на 5'-конце выступа.

50. Способ по п. 37, отличающийся тем, что связанные транспозазы удаляют из двухцепочечных фрагментов перед заполнением гэпа и достройкой двухцепочечных фрагментов геномной ДНК.

51. Способ по п. 37, отличающийся тем, что транспозазы представляют собой транспозазы Tn5, каждая из которых образует комплекс с ДНК транспозона, где ДНК транспозона включает двухцепочечный сайт связывания Tnp длиной 19 п.о. и выступ, который включает баркод-последовательность и сайт связывания праймера.

52. Способ по п. 37, отличающийся тем, что геномная ДНК происходит из пренатальной клетки.

53. Способ по п. 37, отличающийся тем, что геномна ДНК происходит из злокачественной опухолевой клетки.

54. Способ по п. 37, отличающийся тем, что геномная ДНК происходит из циркулирующей злокачественной опухолевой клетки.

55. Способ по п. 37, отличающийся тем, что геномная ДНК происходит из одной пренатальной клетки.

56. Способ по п. 37, отличающийся тем, что геномная ДНК происходит из одной злокачественной опухолевой клетки.

57. Способ по п. 37, отличающийся тем, что геномная ДНК происходит из одной циркулирующей злокачественной опухолевой клетки.

58. Способ по п. 37, отличающийся тем, что сайт связывания праймера представляет собой специфический сайт связывания ПЦР-праймера.

59. Способ сборки геномной ДНК de novo, включающий

контакт транспозаз с множеством ДНК транспозона в физически разделенных реакционных камерах с образованием транспозом в каждой физически отделенной реакционной камере, где каждая ДНК транспозона включает общий сайт связывания транспозазы, общий сайт связывания праймера и баркод-последовательность, где баркод-последовательность является одинаковой для всех ДНК транспозона в той же самой реакционной камере, но отличается от ДНК транспозона в других реакционных камерах,

сбор транспозом из каждой реакционной камеры и смешивание всех транспозом с образованием библиотеки транспозом

формирование библиотеки транспозомных реагентов в реакционном объеме, где по существу все или все транспозомы внутри библиотеки транспозомных реагентов имеют уникальную ассоциированную баркод-последовательность,

контакт геномной ДНК с библиотекой транспозомных реагентов в реакционном объеме, где транспозомы связываются с точками-мишенями вдоль геномной ДНК, а транспозаза расщепляет геномную ДНК на множество двухцепочечных фрагментов геномной ДНК, представляющих библиотеку фрагментов геномной ДНК, причем каждый двухцепочечный фрагмент геномной ДНК включает по одному элементу уникальной пары баркод-последовательностей на каждом из концов фрагмента геномной ДНК,

заполнение гэпа между ДНК транспозона и фрагментом геномной ДНК с образованием библиотеки продуктов достройки фрагмента двухцепочечной геномной ДНК, имеющих сайты связывания праймера на каждом из концов в реакционном объеме,

амплификация продуктов достройки двухцепочечных фрагментов геномной ДНК с получением ампликонов в реакционном объеме,

секвенирование ампликонов в реакционном объеме, и

с помощью вычислительного устройства связывание ампликонов друг с другом путем сопоставления баркодов для сборки геномной ДНК de novo.

60. Способ по п. 59, отличающийся тем, что реакционными камерами являются пробирки, многолуночные планшеты, чипы-микроэрреи, микролунки, микрореакторы, микрокапли, гидрогель микрочастиц или другие способы компартментализации.

61. Способ по п. 23, отличающийся тем, что сборка de novo с разделением по гаплотипу происходит в области антигена лейкоцитов человека, области рекомбинации V (D) J или других областях отдельных клеток человека.