Способы очистки днк и очищенна  днк - RU2001135838A

Реферат

1. Способ очистки плазмидной ДНК из ее смеси, по крайней мере, с одной примесью клетки-хозяина, включающий следующие стадии:

(a) приготовление раствора путем добавления достаточного количества соли к указанной смеси для обеспечения избирательного связывания указанной, по крайней мере, одной примеси клетки-хозяина средой для гидрофобных взаимодействий;

(b) контактирование указанного раствора, содержащего плазмидную ДНК, с указанной средой для гидрофобных взаимодействий в условиях, в которых указанная, по крайней мере, одна примесь связывается со средой для гидрофобных взаимодействий с образованием комплекса; и

(c) сбор несвязанной плазмидной ДНК из указанных комплекса и среды для гидрофобных взаимодействий;

причем указанный способ осуществляют в отсутствие растворителей, детергентов, гликолей, гексамина кобальта, спермидина и поливинилпирролидона.

2. Способ по п.1, где, по крайней мере, одну примесь выбирают из группы, которая включает РНК, эндотоксин, хромосомную ДНК и белок.

3. Способ по п.1, где, по крайней мере, одной примесью является эндотоксин.

4. Способ по п.1, где соль охватывает анион или катион, выбранный из группы, которая включает ацетат, фосфат, карбонат, SO, Cl^-, Br^-, NO, Mg²⁺, Li⁺, Na⁺, K⁺, NH.

5. Способ по п.4, где солью является сульфат аммония в диапазоне концентраций от 2 до 4 М.

6. Способ по п.5, где сульфат аммония присутствует в концентрации примерно 2 М.

7. Способ по п.1, где раствор содержит соли натрия в диапазоне концентраций от 2 до 4 М.

8. Способ по п.7, где солью натрия является хлорид натрия.

9. Способ по п.8, где солью натрия является хлорид натрия в концентрации примерно 2 М.

10. Способ по п.1, где рН раствора находится в диапазоне от примерно 6,8 до примерно 7,4.

11. Способ по п.1, где рН раствора составляет примерно 7,4.

12. Способ по п.1, где среда для гидрофобных взаимодействий включает хроматографический носитель с присоединенными гидрофобными группами.

13. Способ по п.12, где указанные присоединенные группы выбирают из группы, которая включает С₃-С₁₀-алкильные группы и их смеси.

14. Способ по п.12, где среду для гидрофобных взаимодействий выбирают из группы, которая включает метакрилатный полимер или сополимерную основу, соединенные, по крайней мере, с одним пропильным, бутильным, гексильным, октильным, нонильным или децильным лигандом.

15. Способ по п.14, где среда является, по крайней мере, одной из основы сополимера метакрилата и этиленгликоля или основы перекрестно-сшитой агарозы.

16. Способ по п.12, где смола имеет форму гранул размером в диапазоне 15-100 мкм.

17. Способ выделения сверхскрученной плазмидной ДНК из смеси сверхскрученной плазмидной ДНК и деспирализованной плазмидной ДНК и необязательно, по крайней мере, от одной примеси клетки-хозяина, включающий следующие стадии:

(a) приготовление раствора путем добавления соли к смеси сверхскрученной плазмидной ДНК и деспирализованной плазмидной ДНК и указанной, по крайней мере, одной примеси клетки-хозяина, если она вообще присутствует;

(b) контакт раствора со средой для гидрофобных взаимодействий в первых условиях, при которых и сверхскрученная плазмидная ДНК, и деспирализованная плазмидная ДНК связываются со средой для гидрофобных взаимодействий с образованием первой связанной смеси;

(c) изменение первых условий, окружающих первую связанную смесь, на вторые условия с целью удаления деспирализованной плазмидной ДНК из первой связанной смеси с получением раздельных компонентов, включающих вторую связанную смесь и деспирализованную плазмидную ДНК; и

(d) модифицирование вторых условий, окружающих указанную вторую связанную смесь, в третьи условия с целью отделения сверхскрученной плазмидной ДНК от указанной второй связанной смеси с получением раздельных компонентов, включающих среду для гидрофобных взаимодействий и сверхскрученную плазмидную ДНК.

18. Способ по п.17, где, по крайней мере, одну из примесей от клетки-хозяина выбирают из группы, которая включает РНК, эндотоксин, хромосомную ДНК и белок.

19. Способ по п.17, где, по крайней мере, одной примесью от клетки-хозяина является эндотоксин.

20. Способ по п.17, где среда для гидрофобных взаимодействий включает хроматографический носитель с присоединенными гидрофобными группами.

21. Способ по п.20, где указанные присоединенные группы выбирают из группы, которая включает С₃-С₁₀-алкильные группы.

22. Способ по п.20, где среду для гидрофобных взаимодействий выбирают из группы, которая включает метакрилатный полимер или сополимерную основу, соединенные, по крайней мере, с одним из пропильного, бутильного, гексильного, октильного, нонильного лиганда или смеси указанных лигандов.

23. Способ по п.20, где среда является, по крайней мере, одной из основы сополимера метакрилата и этиленгликоля или основы перекрестно-сшитой агарозы.

24. Способ по п.20, где среда является смолой в форме гранул размером в диапазоне 15-100 мкм.

25. Способ по п.17, где соль охватывает анион или катион, выбранный из группы, которая включает ацетат, фосфат, карбонат, SO, Cl^-, Br^-, NO, Mg²⁺, Li⁺, Na⁺, К⁺, NH.

26. Способ по п.25, где солью является сульфат аммония в диапазоне концентраций от 2,5 до 4 М.

27. Способ по п.17, где первые условия включают уравновешивание указанной среды солевым раствором, содержащим сульфат аммония, который присутствует в диапазоне концентраций от примерно 2,5 до 4 М.

28. Способ по п.17, где вторые условия включают промывку среды солевым раствором, содержащим сульфат аммония в концентрации от примерно 2,35 до примерно 2,45 М.

29. Способ по п.17, где указанные третьи условия включают промывку указанной второй связанной смеси солевым раствором, содержащим сульфат аммония в концентрации от примерно 1 до 2,3 М.

30. Способ отделения эндотоксина от плазмидной ДНК, включающий контактирование смеси эндотоксина и плазмидной ДНК со средой для гидрофобных взаимодействий в условиях, при которых указанный эндотоксин связывается с указанной средой для гидрофобных взаимодействий с образованием комплекса, и разделение указанной плазмидной ДНК и указанного комплекса.

31. Способ по п.30, где соль охватывает анион или катион, выбранный из группы, которая включает ацетат, фосфат, карбонат, SO, Cl^-, Br^-, NO, Mg²⁺, Li⁺, Na⁺, K⁺, NH.

32. Способ по п.30, где указанная смесь дополнительно содержит соль аммония в диапазоне концентраций 1,5-4 М.

33. Способ по п.32, где указанной солью аммония является сульфат аммония, который присутствует в концентрации примерно 2 М.

34. Способ по п.30, где среда для гидрофобных взаимодействий включает хроматографический носитель с присоединенными гидрофобными группами.

35. Способ по п.34, где указанные присоединенные группы выбирают из группы, которая включает С₃-С₁₀-алкильные группы.

36. Способ по п.34, где среду для гидрофобных взаимодействий выбирают из группы, которая включает метакрилатный полимер или сополимерную основу, соединенные, по крайней мере, с одним из пропильного, бутильного, гексильного, октильного, нонильного лиганда или смеси указанных лигандов.

37. Способ по п.34, где среда является, по крайней мере, одной из основы сополимера метакрилата и этиленгликоля или перекрестно-сшитой агарозы.

38. Способ по п.34, где среда является смолой в форме гранул размером в диапазоне 15-100 мкм.

39. Способ по п.30, где указанная смесь характеризуется рН в диапазоне от примерно 6,8 до примерно 7,4.

40. Способ по п.35, где рН составляет примерно 7,4.

41. Способ отделения сверхскрученной плазмидной ДНК от деспирализованной плазмидной ДНК, включающий контактирование смеси сверхскрученной плазмидной ДНК и деспирализованной плазмидной ДНК со средой для гидрофобных взаимодействий в первых условиях, при которых и сверхскрученная плазмидная ДНК, и деспирализованная плазмидная ДНК связываются с указанной средой для гидрофобных взаимодействий с образованием первой связанной смеси, изменение указанных первых условий, окружающих первую связанную смесь, на вторые условия с целью удаления указанной деспирализованной плазмидной ДНК из указанной первой связанной смеси с получением раздельных компонентов, включающих вторую связанную смесь и указанную деспирализованную плазмидную ДНК, и модифицирование вторых условий, окружающих указанную вторую связанную смесь, в третьи условия с целью удаления указанной сверхскрученной плазмидной ДНК из указанной второй связанной смеси с получением раздельных компонентов, включающих указанную среду для гидрофобных взаимодействий и указанную сверхскрученную плазмидную ДНК.

42. Способ по п.41, где указанная среда для гидрофобных взаимодействий включает хроматографический носитель с присоединенными гидрофобными группами.

43. Способ по п.42, где указанные присоединенные гидрофобные группы выбирают из группы, которая включает С₃-С₁₀-алкильные группы и их смеси.

44. Способ по п.41, где указанная гидрофобная смола является метакрилатным полимером или сополимерной основой, соединенными, по крайней мере, с одним из пропильного, бутильного, пентильного, гексильного, гептильного, октильного, нонильного или децильного лиганда.

45. Способ по п.44, где указанная смола является, по крайней мере, одной из основы сополимера метакрилата и этиленгликоля или перекрестно-сшитой агарозы.

46. Способ по п.41, где указанная смола имеет форму гранул размером в диапазоне 15-100 мкм.

47. Способ по п.41, где указанные первые условия включают уравновешивание указанных смеси и среды солевым раствором, содержащим сульфат аммония, который присутствует в диапазоне концентраций от примерно 2, 5 до 4 М.

48. Способ по п.47, где указанные вторые условия включают промывку указанной первой связанной смеси солевым раствором, содержащим сульфат аммония в концентрации от примерно 2, 35 до примерно 2,45 М.

49. Способ по п.48, где указанные третьи условия включают промывку указанной второй связанной смеси солевым раствором, содержащим сульфат аммония в концентрации от примерно 1 до 2,3 М.

50. Способ по любому из пп.17 и 41, где указанное изменение и указанное модифицирование объединяют в непрерывный процесс, включающий градиентную элюцию указанных деспирализованной плазмидной ДНК и сверхскрученной плазмидной ДНК путем смешивания указанной первой связанной смеси с сульфатом аммония, включающий солевой раствор с непрерывно изменяющейся концентрацией сульфата аммония, где указанная концентрация изменяется от примерно 3 до примерно 1 М сульфата аммония, и указанную деспирализованную плазмидную ДНК собирают в первом элюированном объеме и указанную сверхскрученную плазмидную ДНК собирают во втором элюированном объеме.

51. Способ по п.41, где указанный отдельный компонент деспирализованной плазмидной ДНК и указанную отдельную сверхскрученную плазмидную ДНК собирают и изолируют.

52. Способ обогащения количества сверхскрученной ДНК по отношению к деспирализованной ДНК в их смеси, где способ включает:

(1) взаимодействие смеси, содержащей сверхскрученную ДНК и деспирализованную ДНК со средой для гидрофобных взаимодействий, включающей алькильную составляющую, в таких ионных условиях, при которых сверхскрученная ДНК преимущественно связывается со средой для гидрофобных взаимодействий;

(2) обработку среды для гидрофобных взаимодействий, несущей деспирализованную и сверхскрученную ДНК, при таких ионных условиях, которые обеспечивают преимущественное удаление деспирализованной ДНК; и

(3) элюцию сверхскрученной ДНК со среды для гидрофобных взаимодействий.

53. Способ удаления липополисахарида (ЛПС) из композиции, содержащей ДНК, где способ включает:

(1) взаимодействие смеси, содержащей ДНК и ЛПС, со средой для гидрофобных взаимодействий, включающей алкильную составляющую, где взаимодействие имеет место при таких ионных условиях, при которых ЛПС связывается со средой для гидрофобных взаимодействий преимущественно по сравнению с ДНК; и

(2) обработку среды для гидрофобных взаимодействий, несущей ДНК и ЛПС, в таких ионных условиях, которые обеспечивают избирательное отделение ДНК.