Тагментация с применением иммобилизованных транспосом с линкерами - RU2018140894A

1. Комплекс транспосомы, содержащий:

(i) транспозазу,

(ii) первый транспозон, содержащий:

(a) 3’-часть, содержащую концевую последовательность первого транспозона; и

(b) первую адапторную последовательность на 5’-конце концевой последовательности первого транспозона;

(iii) второй транспозон, содержащий концевую последовательность второго транспозона, комплементарную по меньшей мере части концевой последовательности первого транспозона; и

(iv) линкер, присоединенный к указанному первому или второму транспозону и содержащий аффинный элемент.

2. Комплекс по п. 1, отличающийся тем, что указанный линкер присоединен ко второму транспозону на 3’-конце указанного второго транспозона.

3. Комплекс по п. 2, отличающийся тем, что второй конец указанного линкера присоединен к указанному аффинному элементу.

4. Комплекс по п. 3, отличающийся тем, что указанные линкер и аффинный элемент имеют структуру формулы (I):

где

АЭ представляет собой аффинный элемент;

Y представляет собой C₂-₆алкилен;

X¹ представляет собой O, NR¹ или S;

где R¹ представляет собой H или алкил C₁-₁₀;

n представляет собой целое число от 1 до 6;

X² представляет собой O, CH₂ или S;

R^a представляет собой H или -OH; и

Z отсутствует, если R^a представляет собой H, или представляет собой CH₂, если R^a представляет собой H или OH;

при этом символом обозначена точка присоединения ко второму транспозону.

5. Комплекс по п. 4, отличающийся тем, что фосфатная группа в формуле (I) соединена с 3’-гидроксилом концевого нуклеотида указанного второго транспозона.

6. Комплекс по п. 4 или 5, отличающийся тем, что АЭ содержит или представляет собой необязательно замещенный биотин или аминогруппу.

7. Комплекс по п. 6, отличающийся тем, что АЭ представляет собой биотин.

8. Комплекс по любому из пп. 4-7, отличающийся тем, что Y представляет собой алкилен C₂-₆, алкилен C₂-₅, алкилен C₂-₄или алкилен C₂-₃.

9. Комплекс по п. 8, отличающийся тем, что Y представляет собой этилен, пропилен или бутилен.

10. Комплекс по любому из пп. 4-9, отличающийся тем, что X¹ представляет собой NR¹, а R¹ представляет собой H или алкил C₁-₁₀.

11. Комплекс по п. 10, отличающийся тем, что R¹ представляет собой H.

12. Комплекс по любому из пп. 4-11, отличающийся тем, что n равен 1 или 2.

13. Комплекс по любому из пп. 4-12, отличающийся тем, что X² представляет собой CH₂.

14. Комплекс по любому из пп. 4-12, отличающийся тем, что X² представляет собой O.

15. Комплекс по любому из пп. 4-14, отличающийся тем, что R^a представляет собой H, а Z отсутствует.

16. Комплекс по любому из пп. 4-14, где R^a представляет собой H, а Z представляет собой CH₂.

17. Комплекс по любому из пп. 4-14, где R^a представляет собой -OH, а Z представляет собой CH₂.

18. Комплекс по п. 4, отличающийся тем, что указанный линкер и аффинный элемент имеют структуру формулы (I’):

где Z отсутствует или представляет собой CH₂.

19. Комплекс по п. 4, отличающийся тем, что указанный линкер и аффинный элемент имеют структуру формулы (Ia):

20. Комплекс по п. 4, отличающийся тем, что указанный линкер и аффинный элемент имеют структуру формулы (Ib) или (Ic):

где n равен 1 или 2;

X² представляет собой O или CH₂; и

Z отсутствует или представляет собой CH₂.

21. Комплекс по п. 4, отличающийся тем, что указанный линкер и аффинный элемент имеют структуру, выбранную из группы, состоящей из:

22. Комплекс по любому из пп. 1-21, отличающийся тем, что указанная транспозаза представляет собой транспозазу Tn5.

23. Комплекс по п. 22, отличающийся тем, что указанная транспозаза Tn5 представляет собой транспозазу Tn5 дикого типа или гиперактивную транспозазу Tn5, или ее мутант, при этом указанная транспозаза необязательно конъюгирована с меткой очистки.

24. Комплекс по п. 22 или 23, отличающийся тем, что концевая последовательность первого транспозона и концевая последовательность второго транспозона представлены ME и ME’.

25. Комплекс по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что первая адапторная последовательность содержит последовательность праймера.

26. Комплекс по п. 25, отличающийся тем, что указанная первая адапторная последовательность содержит A14 или B15.

27. Композиция, содержащая первый комплекс по п. 25, отличающийся тем, что указанный первый адаптор содержит первую последовательность праймера, и второй комплекс по п. 25, отличающийся тем, что указанный первый адаптор содержит вторую последовательность праймера.

28. Композиция по п. 27, отличающаяся тем, что первая последовательность праймера содержит A14, а вторая последовательность праймера содержит B15.

29. Модифицированный олигонуклеотид, содержащий первый транспозон и второй транспозон, отличающийся тем, что указанный первый транспозон содержит (a) 3’-часть, содержащую концевую последовательность первого транспозона, и (b) первую адапторную последовательность на 5’-конце концевой последовательности первого транспозона, а указанный второй транспозон содержит концевую последовательность второго транспозона, комплементарную по меньшей мере части концевой последовательности указанного первого транспозона и аннелированную с ней, и при этом первый конец линкера присоединен к 3’-концу указанного второго транспозона, а второй конец указанного линкера присоединен к аффинному элементу.

30. Модифицированный олигонуклеотид по п. 29, отличающийся тем, что указанный линкер и аффинный элемент имеют структуру формулы (I), (I’), (Ia), (Ib), (Ic), (I(a)), (I(b)) или (I(c)) по любому из пп. 1-28.

31. Комплекс по любому из пп. 1-26, отличающийся тем, что указанный аффинный элемент связан с партнером для аффинного связывания на твердой подложке, за счет чего указанный комплекс связан с указанной твердой подложкой.

32. Комплекс по п. 31, отличающийся тем, что указанный аффинный элемент представляет собой биотин, а партнер для аффинного связывания представляет собой стрептавидин.

33. Комплекс по п. 31 или 32, отличающийся тем, что указанная твердая подложка представляет собой гранулу или парамагнитную гранулу.

34. Композиция по любому из пп. 27-28, отличающаяся тем, что указанный аффинный элемент связан с партнером для аффинного связывания на твердой подложке, за счет чего указанная композиция связана с указанной твердой подложкой.

35. Композиция по п. 34, отличающаяся тем, что указанный аффинный элемент представляет собой биотин, а партнер для аффинного связывания представляет собой стрептавидин.

36. Композиция по п. 34 или 35, отличающаяся тем, что указанная твердая подложка представляет собой гранулу или парамагнитную гранулу.

37. Способ получения библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот из двухцепочечной целевой нуклеиновой кислоты, включающий инкубацию указанной целевой нуклеиновой кислоты со связанным комплексом по любому из пп. 31-33 или композицией по любому из пп.34-36 в условиях, достаточных для фрагментации указанной целевой нуклеиновой кислоты на множество целевых фрагментов, и для присоединения 3’-конца первого транспозона к 5’-концам целевых фрагментов с получением множества 5’-меченых целевых фрагментов.

38. Способ по п. 37, дополнительно включающий амплификацию одного или более из 5’-меченых целевых фрагментов.

39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанная амплификация включает получение и/или амплификацию полностью дуплексных 5’-меченых целевых фрагментов.

40. Способ по п. 38 или 39, отличающийся тем, что указанная амплификация включает инкубацию по меньшей мере одного полностью дуплексного 5’-меченого целевого фрагмента, содержащего последовательность праймера на каждом конце с носителем вторичного адаптора, одиночными нуклеотидами и полимеразой, в условиях, достаточных для амплификации указанных целевых фрагментов и инсерции указанного носителя вторичного адаптора, который содержит последовательность, комплементарную последовательности праймера, и вторичную адапторную последовательность, с получением таким образом библиотеки фрагментов для секвенирования.

41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что указанный носитель вторичного адаптора содержит последовательность праймера, индексную последовательность, «штрихкодирующую» последовательность, метку очистки или их комбинацию.

42. Способ по п. 41, отличающийся тем, что указанный носитель вторичного адаптора содержит индексную последовательность и последовательность праймера.

43. Способ по любому из пп. 39-42, отличающийся тем, что указанные полностью дуплексные 5’-меченые целевые фрагменты содержат разные последовательности праймера на каждом конце, при этом необязательно указанные разные последовательности праймеров представляют собой A14 и B15.

44. Способ по любому из пп. 41-43, отличающийся тем, что каждый из указанных носителей вторичного адаптора содержит одну из двух последовательностей праймеров, при этом необязательно указанные две последовательности праймеров представляют собой последовательность праймера P5 и последовательность праймера P7, и одну из множества индексных последовательностей.

45. Способ по любому из пп. 37-44, отличающийся тем, что указанные фрагменты гибридизуют с комплементарными праймерами, привитыми на проточную ячейку или твердую подложку.

46. Способ по любому из пп. 37-45, дополнительно включающий секвенирование одного или более из 5’-меченых целевых фрагментов или продуктов их амплификации.

47. Способ получения связанного с твердой подложкой комплекса транспосомы, включающий обработку транспозазы модифицированным олигонуклеотидом по п. 29 или 30, в условиях, достаточных для связывания указанной транспозазы и модифицированного олигонуклеотида в комплекс транспосомы.

48. Способ по п. 47, дополнительно включающий инкубацию указанного комплекса транспосомы с твердой подложкой, содержащей партнер для аффинного связывания, в условиях, достаточных для того, чтобы указанный аффинный элемент связался с указанным партнером для аффинного связывания.

49. Комплекс транспосомы по п. 1, отличающийся тем, что указанный линкер представляет собой расщепляемый линкер.

50. Комплекс транспосомы по п. 49, отличающийся тем, что указанный расщепляемый линкер присоединен к 5’-концу указанной первой адапторной последовательности.

51. Комплекс транспосомы по п. 1, отличающийся тем, что указанный линкер присоединен к 5’-концу указанного первого транспозона, а указанный линкер представляет собой расщепляемый линкер.

52. Комплекс по п. 51, отличающийся тем, что указанный аффинный элемент связан с партнером для аффинного связывания на твердой подложке.

53. Комплекс по п. 52, отличающийся тем, что указанная твердая подложка представляет собой пробирку, лунку планшета, предметное стекло или слайд, гранулу или проточную ячейку, при этом необязательно указанная твердая подложка представляет собой парамагнитную гранулу.

54. Комплекс по п. 52 или 53, отличающийся тем, что указанный аффинный элемент представляет собой биотин, а партнер для аффинного связывания представляет собой стрептавидин.

55. Комплекс по любому из пп. 52-54, отличающийся тем, что указанная адапторная последовательность содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из универсальных последовательностей, последовательностей праймеров или связанных с секвенированием последовательностей.

56. Способ получения образца для секвенирования, включающий:

получение комплекса по любому из пп. 52-55;

нанесение нуклеиновой кислоты на указанный комплекс в условиях, подходящих для тагментации, с иммобилизацией таким образом фрагментов целевой нуклеиновой кислоты на твердой подложке;

амплификацию иммобилизованных тагментированных нуклеиновых кислот;

расщепление расщепляемого фрагмента; и

обогащение целевыми амплифицированными нуклеиновыми кислотами, с получением таким образом образца для секвенирования.

57. Способ по п. 56, отличающийся тем, что указанный расщепляемый линкер содержит фоторасщепляемый или расщепляемый ферментативным путем нуклеотид, при этом необязательно указанный расщепляемый нуклеотид представляет собой урацил, уридин, 8-оксо-гуанин, ксантин, гипоксантин, 5,6-дигидроурацил, 5-метилцитозин, тиминовый димер, 7-метилгуанозин, 8-оксо-дезоксигуанозин, ксантозин, инозин, дигидроуридин, бромдезоксиуридин, уридин или 5-метилцитидин, при этом необязательно указанный расщепляемый нуклеотид представляет собой урацил.

58. Способ по п. 57, отличающийся тем, что расщепление осуществляют ферментом, представляющим собой (a) гликозилазу, необязательно выбранную из группы, состоящей из урацил-ДНК-гликозилазы, MUG, SMUG, TDG или MBD4, при этом необязательно указанная гликозилаза представляет собой урацил-ДНК-гликозилазу, или (b) представляющим собой апуриновую/aпиримидиновую (АП) эндонуклеазу, при этом необязательно указанная АП-эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из Endo VIII, Endo IV или Endo V, при этом необязательно указанная АП-эндонуклеаза представляет собой Endo VIII.

59. Способ по любому из пп. 56-58, отличающийся тем, что указанная твердая подложка содержит гранулы, необязательно парамагнитные гранулы.

60. Способ по любому из пп. 56-59, отличающийся тем, что указанная нуклеиновая кислота представляет собой (a) ДНК, при этом необязательно указанная ДНК является двухцепочечной, необязательно при этом указанная двухцепочечная ДНК представляет собой геномную ДНК, необязательно при этом указанную геномную ДНК выбирают из группы, включающей нуклеиновые кислоты одиночной клетки, ткани, опухоли, крови, плазмы, мочи или внеклеточные нуклеиновые кислоты, или (b) РНК или ее производное, или кДНК.

61. Способ по любому из пп. 56-60, отличающийся тем, что указанный этап амплификации включает что-либо одно или более из ПЦР или изотермической амплификации, или указанный этап амплификации представлен ПЦР.

62. Способ по любому из пп. 56-61, отличающийся тем, что последовательность транспозона дополнительно содержит одну или более адапторных последовательностей, выбранных из группы, содержащей универсальные последовательности, последовательности праймеров или связанные с секвенированием последовательности.