Модифицированная сульфамидаза и способ её получения - RU2016140844A
Код документа: RU2016140844A
Формула
1. Модифицированная сульфамидаза, отличающаяся тем, что по существу не включает эпитопы, распознаваемые гликан-распознающими рецепторами, что позволяет проникать указанной сульфамидазе через гематоэнцефалический барьер млекопитающего и проявлять каталитическую активность в его головном мозге.
2. Модифицированная сульфамидаза по п. 1, отличающаяся тем, что относительное содержание природных гликановых группировок в ней составляет приблизительно 25% от содержания природных гликановых группировок в немодифицированной рекомбинантной сульфамидазе.
3. Модифицированная сульфамидаза по п. 1, отличающаяся тем, что природные гликановые группировки в ней разрушены в результате разрывов одинарных и двойных связей, при этом частота разрыва одинарных связей составляет по меньшей мере 60% в олигоманнозных гликанах.
4. Модифицированная сульфамидаза по п. 1, отличающаяся тем, что указанные эпитопы представляют собой по меньшей мере один тип группировки, выбранной из маннозо-6-фосфатной группировки, маннозной группировки и галактозной группировки.
5. Модифицированная сульфамидаза по п. 4, не включающая маннозо-6-фосфатные группировки, маннозные группировки и галактозные группировки.
6. Модифицированная сульфамидаза по п. 4, отличающаяся тем, что указанные эпитопы распознаются по меньшей мере одним гликан-распознающим рецептором, выбранным из маннозо-6-фосфатного рецептора типа 1 и 2, маннозного рецептора и галактозного рецептора.
7. Модифицированная сульфамидаза по п. 1, включающая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO 1, или полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичности
последовательности с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 1.
8. Модифицированная сульфамидаза по п. 7, отличающаяся тем, что указанные эпитопы отсутствуют по меньшей мере на четырех из пяти участков N-гликозилирования: N в положении 21 (N(21)), N в положении 122 (N(122)), N в положении 131 (N(131)), N в положении 244 (N(244)) и N в положении 393 (N(393)) SEQ ID NO 1.
9. Модифицированная сульфамидаза по п. 8, отличающаяся тем, что указанные эпитопы отсутствуют на участках N-гликозилирования N(21), N(122), N(244) и N(393) указанного полипептида модифицированной сульфамидазы.
10. Модифицированная сульфамидаза по п. 7, включающая олигоманнозный гликан на участке N(131), в котором олигоманноза разрушена в результате разрывов одинарных и двойных связей, при этом разрушение характеризуется частотой разрывов одинарных связей по меньшей мере 60%.
11. Модифицированная сульфамидаза по п. 7, отличающаяся тем, что указанная сульфамидаза неизменна в ее С-концевой части, необязательно представленной аминокислотами 436-484 из SEQ ID NO 1.
12. Модифицированная сульфамидаза по п. 7, включающая остаток Сα-формилглицина в положении 50 SEQ ID NO 1 (FGly50), что обеспечивает указанную каталитическую активность.
13. Модифицированная сульфамидаза по п. 1, отличающаяся тем, что указанная каталитическая активность обеспечивает снижение лизосомального накопления в головном мозге указанного млекопитающего, страдающего лизосомной болезнью накопления.
14. Модифицированная сульфамидаза, отличающаяся тем, что ее получают в ходе последовательной реакции с периодатом щелочного металла и боргидридом щелочного металла, тем самым модифицируют эпитопы сульфамидазы, распознаваемые гликан-распознающими рецепторами и
уменьшают активность сульфамидазы в отношении указанных рецепторов, сохраняя каталитическую активность указанной сульфамидазы.
15. Композиция сульфамидазы, включающая модифицированную сульфамидазу, не имеющую по существу эпитопов, распознаваемых гликан-распознающими рецепторами, что позволяет проникать указанной сульфамидазе через гематоэнцефалический барьер млекопитающего, и имеющую отношение Сα-формилглицина (FGly) к серину (Ser) на активном участке больше 1, что обеспечивает каталитическую активность в головном мозге указанного млекопитающего.
16. Композиция сульфамидазы по п. 15, включающая модифицированную сульфамидазу, как определено в любом из пп. 1-14.
17. Композиция сульфамидазы по п. 15, включающая не больше 5 мас. % сульфамидазы в мультимерных формах, имеющих молекулярную массу свыше 1010 кДа.
18. Способ получения модифицированной сульфамидазы, согласно которому:
a) гликозилированную сульфамидазу подвергают взаимодействию с периодатом щелочного металла, и
b) указанную сульфамидазу подвергают взаимодействию с боргидридом щелочного металла в течение периода времени не больше, чем 2 часа;
тем самым модифицируют гликановые группировки сульфамидазы и уменьшают активность сульфамидазы в отношении рецепторов, распознающих гликаны, сохраняя ее каталитическую активность.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанный боргидрид используют в концентрации от 10 до 80 ммоль/л.
20. Способ по п. 18, отличающийся тем, что стадию а) проводят в течение периода времени не больше, чем 4 часа, например, не больше, чем 3 часа, например, не больше, чем 2 часа, например, не больше, чем 1 час, например, приблизительно 0,5 часа.
21. Способ по п. 18, отличающийся тем, что стадию а) и стадию b) осуществляют последовательно без проведения промежуточной стадии.
22. Способ по п. 18, отличающийся тем, что стадия а) дополнительно характеризуется по меньшей мере одним, например, по меньшей мере двумя, например, всеми пунктами i)-iii):
i) указанный периодат щелочного металла представляет собой метапериодат натрия;
ii) указанный периодат используют в концентрации не более 20 ммоль/л, например, не более 15 ммоль/л, например, приблизительно 10 ммоль/л, и
iii) указанную реакцию проводят при температуре от 0 до 22°С, например, при температуре 0-8°С, например, при температуре 0-4°С, например, приблизительно 8°С, например, приблизительно 0°С.
23. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанную реакцию стадии а) проводят при рН 3-7.
24. Способ по п. 18, отличающийся тем, что стадия b) дополнительно характеризуется по меньшей мере одним, например, по меньшей мере двумя, например, всеми пунктами i)-iv):
i) указанный боргидрид щелочного металла представляет собой боргидрид натрия;
ii) указанный боргидрид используют в концентрации, не превышающей концентрацию указанного периодата больше, чем в 4 раза, например, не превышающей концентрацию указанного периодата больше, чем в 3 раза, например, не превышающей концентрацию указанного периодата больше, чем в 2,5 раза, например, не превышающей концентрацию указанного периодата в 0,5-4 раза;
iii) указанную реакцию проводят в течение периода времени не больше, чем 1,5 часа, например, не больше, чем 1 час, например, не больше, чем 0,75 часа, например, приблизительно 0,5 часа, и
iv) указанную реакцию проводят при температуре от 0 до 8°С.
25. Способ по п. 18, отличающийся тем, что стадию а) и стадию b) каждую выполняют по отдельности в течение периода времени не больше, чем 2 часа, и указанный боргидрид необязательно используют в концентрации, превышающей концентрацию указанного периодата в 0,5-4 раза.
26. Способ по п. 18, отличающийся тем, что стадию а) проводят в течение периода времени не больше, чем 3 часа, и стадию b) проводят в течение периода времени не больше, чем 1 час, и указанный боргидрид необязательно используют в концентрации, не превышающей концентрацию указанного периодата больше, чем в 4 раза.
27. Способ по п. 18, дополнительно включающий стадию а2), на которой гасят реакцию, проходящую на стадии а).
28. Способ по 18, дополнительно включающий стадию b2), на которой гасят реакцию, проходящую на стадии b).
29. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанный гликозилированный полипептид сульфамидазы включает гликановые группировки по меньшей мере на четырех остатках аспарагина.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанный периодат щелочного металла окисляет цис-гликольные группы гликановых группировок до альдегидных групп.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что указанный боргидрид щелочного металла восстанавливает указанные альдегиды до спиртов.
32. Модифицированная сульфамидаза, получаемая способом по любому из пп. 18-31.
33. Модифицированная сульфамидаза или композиция сульфамидазы по любому из пп. 1-17 и 32 для применения в лечении.
34. Модифицированная сульфамидаза или композиция сульфамидазы по п. 33 для применения в лечении млекопитающего, страдающего лизосомной болезнью накопления, в частности мукополисахаридозом IIIA (МПС IIIA).
35. Способ лечения млекопитающего, страдающего лизосомной болезнью накопления, такой как мукополисахаридоз IIIA (МПС IIIA), согласно которому млекопитающему вводят терапевтически эффективное количество модифицированной сульфамидазы, выбранной из:
a) модифицированной сульфамидазы по любому из пп. 1-14 и 32;
b) композиции сульфамидазы по любому из пп. 15-17 и
c) модифицированной сульфамидазы, модификация которой включает последовательную обработку периодатом щелочного металла и боргидридом щелочного металла, в результате чего гликановые группировки сульфамидазы оказываются химически модифицированными таким образом, что уменьшается ее активность в отношении рецепторов, распознающих гликаны, в то же время сохраняется каталитическая ферментативная активность.
