Оптимизированные клетки-хозяева для получения глутатиона - RU2018138132A
Код документа: RU2018138132A
Формула
1. Способ получения глутатиона, где указанный способ включает ферментацию субстрата с использованием генетически модифицированной клетки-хозяина, чтобы получать ферментированную смесь, содержащую глутатион, где генетически модифицированная клетка-хозяин имеет по меньшей мере одну из:
- первой гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный белок цистатионин-β-синтазы (Cys4p), обладающий увеличенной биологической активностью по сравнению с Cys4p дикого типа;
- второй гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный Yap1p, обладающий сниженной способностью к транслокации из ядра в цитоплазму по сравнению с Yap1p дикого типа; и/или
- третей гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок треонинальдолазы (Gly1p).
2. Способ по п. 1, в котором генетически модифицированная клетка-хозяин имеет первую гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты и по меньшей мере одну из второй молекулы нуклеиновой кислоты или третьей гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором мутантный Cys4p представляет собой фрагмент Cys4p дикого типа.
4. Способ по п. 3, в котором мутантный Cys4p получают посредством удаления одного или более C-концевых аминокислотных остатков из Cys4p дикого типа.
5. Способ по п. 4, в котором мутантный Cys4p получают посредством удаления регуляторного домена из Cys4p дикого типа.
6. Способ по п. 5, в котором мутантный Cys4p состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором, в генетически модифицированной клетке-хозяине, по меньшей мере одну копию нативной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей Cys4p дикого типа, заменяют на первую гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты.
8. Способ по любому из пп. 1-6, в котором генетически модифицированная клетка-хозяин содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре копии первой гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты.
9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором мутантный Yap1p имеет по меньшей мере одну замену аминокислоты по сравнению с Yap1p дикого типа.
10. Способ по п. 9, в котором по меньшей мере одна замена аминокислоты находится в домене, соответствующем богатому цистеином домену из Yap1p дикого типа.
11. Способ по п. 10, в котором мутантный Yap1p получают посредством замены остатка цистеина на гидрофильный аминокислотный остаток в домене, соответствующем богатому цистеином домену из Yap1p дикого типа.
12. Способ по п. 11, в котором гидрофильный аминокислотный остаток представляет собой остаток аспарагиновой кислоты.
13. Способ по п. 11 или 12, в котором замененный остаток цистеина находится в положении, соответствующем остатку 626 в SEQ ID NO: 3.
14. Способ по п. 13, в котором мутантный Yap1p содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором, в генетически модифицированной клетке-хозяине, по меньшей мере одну копию нативной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей Yap1p дикого типа, заменяют на вторую гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты.
16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором генетически модифицированная клетка-хозяин содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре копии второй гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты.
17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором генетически модифицированная клетка-хозяин содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре копии третьей гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты.
18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором генетически модифицированная клетка-хозяин содержит:
- первую гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты и вторую гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты;
- первую гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты и третью гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты;
- вторую гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты и третью гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты; или
- первую гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты, вторую гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты и третью гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты.
19. Способ по любому из пп. 1-18, который дополнительно включает переработку ферментированной смеси в дрожжевой экстракт или дрожжевой гидролизат.
20. Способ по любому из пп. 1-19, который дополнительно включает очистку генетически модифицированной клетки-хозяина от ферментированной смеси.
21. Способ по любому из пп. 1-19, который дополнительно включает инактивацию генетически модифицированной клетки-хозяина из ферментированной смеси.
22. Способ по любому из пп. 1-21, который дополнительно включает очистку глутатиона от ферментированной смеси.
23. Способ по любому из пп. 1-22, в котором генетически модифицированная клетка-хозяин представляет собой генетически модифицированную дрожжевую клетку-хозяина.
24. Способ по п. 23, в котором генетически модифицированная дрожжевая клетка-хозяин относится к роду Saccharomyces.
25. Способ по п. 24, в котором генетически модифицированная дрожжевая клетка-хозяин относится к виду Saccharomyces cerevisiae.
26. Ферментированный субстрат, получаемый с помощью способа по любому из пп. 1-25.
27. Дрожжевой экстракт или дрожжевой гидролизат, получаемый с помощью способа по п. 19.
28. Очищенная генетически модифицированная клетка-хозяин, полученная с помощью способа по п. 20.
29. Инактивированная генетически модифицированная клетка-хозяин, полученная с помощью способа по п. 21.
30. Генетически модифицированная клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере две из:
- первой гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный белок цистатионин-β-синтазы (Cys4p), обладающий увеличенной биологической активностью по сравнению с Cys4p дикого типа;
- второй гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный Yap1p, обладающий сниженной способностью к транслокации из ядра в цитоплазму по сравнению с Yap1p дикого типа; и/или
- третьей гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок треонинальдолазы (Gly1p).
31. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 30, содержащая первую гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты и по меньшей мере одну из второй гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты или третьей гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты.
32. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 30 или 31, в которой мутантный Cys4p представляет собой фрагмент Cys4p дикого типа.
33. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 32, где мутантный Cys4p получают посредством удаления одного или более C-концевых аминокислотных остатков из Cys4p дикого типа.
34. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 33, где мутантный Cys4p получают посредством удаления регуляторного домена из Cys4p дикого типа.
35. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 34, в которой мутантный Cys4p состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
36. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из пп. 30-35, в которой по меньшей мере одну копию нативной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей Cys4p дикого типа, заменяют на первую гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты.
37. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из пп. 30-36, содержащая по меньшей мере две, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре копии первой гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты.
38. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из пп. 30-37, в которой мутантный Yap1p имеет по меньшей мере одну замену аминокислоты по сравнению с Yap1p дикого типа.
39. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 38, в которой по меньшей мере одну замена аминокислоты находится в домене, соответствующем богатому цистеином домену из Yap1p дикого типа.
40. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 39, где мутантный Yap1p получают посредством замены остатка цистеина на гидрофильный аминокислотный остаток в домене, соответствующем богатому цистеином домену из Yap1p дикого типа.
41. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 40, в которой гидрофильный аминокислотный остаток представляет собой остаток аспарагиновой кислоты.
42. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 40 или 41, в которой замененный остаток цистеина находится в положении, соответствующем остатку 626 в SEQ ID NO: 3.
43. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 42, в которой мутантный Yap1p содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
44. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из пп. 30-43, в которой по меньшей мере одну копию нативной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей Yap1p дикого типа, заменяют на вторую гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты.
45. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из пп. 30-44, содержащая по меньшей мере две, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре копии второй гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты.
46. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из пп. 30-45, содержащая по меньшей мере две, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре копии третьей гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты.
47. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из пп. 30-46, которая представляет собой генетически модифицированную дрожжевую клетку-хозяина.
48. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 47, где генетически модифицированная дрожжевая клетка-хозяин относится к роду Saccharomyces.
49. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 48, где генетически модифицированная дрожжевая клетка-хозяин относится к виду Saccharomyces cerevisiae.
