Композиция молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы - RU2016102942A

1. Жидкая композиция молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы, содержащая:

(i): молокосвертывающий фермент аспарагиновую протеазу с активностью от 25 IMCU (Международных молокосвертывающих единиц)/г композиции до 30000 IMCU/г композиции;

(ii): полимер в концентрации от 1 млн^-1 до 5000 млн^-1 (масс./масс.), и

(iii): соль в концентрации от 1 до 350 г/кг;

и где рН композиции составляет от 2 до 8;

и где полимер представляет собой полимер, обладающий следующими характеристиками (а), (b) и (с):

(a): полимер представляет собой полимер по меньшей мере одного мономера, выбранного из группы мономеров, состоящей из: этиленоксида, винилполипирролидона, винилового спирта, винилацетата, акрилонитрила, акрилата и метакрилата; и

(b): полимер представляет собой полимер с молекулярной массой от 200 г/моль до 50000 г/моль; и

(c): полимер представляет собой полимер с числом повторяющегося мономера/элемента (так называемым числом "n") от n, равного 5, до n, равного 1250; и

(d): возможно полимер, обладающий приведенными выше характеристиками (а), (b) и (с), может представлять собой замещенный полимер, содержащий одно или более соединений-заместителей, отличных от мономеров, обладающих характеристикой (а), и, если полимер представляет собой замещенный полимер, молекулярная масса замещенного полимера как такового находится в диапазоне характеристики (b), а молекулярная масса соединения(ий)-заместителя(ей) меньше молекулярной массы полимерной части замещенного полимера.

2. Сухая гранулированная композиция молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы, содержащая:

(i): молокосвертывающий фермент аспарагиновую протеазу с активностью от 25 IMCU/г композиции до 30000 IMCU/г композиции;

(ii): полимер в концентрации от 1 млн^-1 до 5000 млн^-1 (масс./масс.), и

(iii): соль;

и где рН композиции, суспендированной в воде, составляет от 2 до 8;

и где полимер представляет собой полимер, обладающий характеристиками (а), (b) и (с) и возможно (d) согласно п. 1.

3. Способ хранения молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы, который включает следующие стадии:

(a): обеспечение композиции молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы по п. 1 или 2; и

(b): хранение композиции в течение периода от 90 суток до 2000 суток при температуре от -10°С до 50°С.

4. Способ получения пищевого или кормового продукта, включающий добавление эффективного количества композиции молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы по п. 1 или 2 к пищевому(ым) или кормовому(ым) ингредиенту(ам) и выполнение последующих стадий изготовления с получением пищевого или кормового продукта, и

где продукт представляет собой продукт на основе молока, и где способ включает добавление к молоку эффективного количества композиции молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы по п. 1 или 2 и выполнение последующих стадий изготовления с получением продукта на основе молока; и

где молоко представляет собой овечье молоко, козье молоко, буйволиное молоко, молоко самки яка, молоко ламы, верблюжье молоко или коровье молоко; и

где продукт на основе молока представляет собой кисломолочный продукт, творог или сыр.

5. Способ по п. 4, где композицию молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы сначала хранят в соответствии со способом хранения молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы по п. 3, а затем добавляют к пищевому(ым) или кормовому(ым) ингредиенту(ам), как указано в п. 4.

6. Способ выделения интересующего молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы из водной среды, содержащей такой интересующий фермент, где способ включает стадии:

(i): получения образца на водной основе, состоящего из ряда компонентов, включающих аспарагиновую протеазу;

(ii): добавления полимера в концентрации от 1 млн^-1 до 10000 млн^-1 к образцу на водной основе со стадии (i) с получением образца, содержащего полимер; и

(iii): выделения аспарагиновой протеазы из образца, содержащего полимер, со стадии (ii) и получение, таким образом, выделенного интересующего молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы;

где полимер представляет собой полимер, обладающий характеристиками (а), (b) и (с) и возможно (d) согласно п. 1.

7. Способ по п. 6 при условии, что этот способ не является способом, в котором ПЭГ и неорганическую соль добавляют к образцу на водной основе со стадии (i) таким образом, чтобы сформировалась жидкостно-жидкостная (водная) двухфазная система, и затем извлекают/выделяют аспарагиновую протеазу из фазы ПЭГ.

8. Способ по п. 6, где стадия выделения (iii) включает следующие стадии:

(A): нанесение образца, содержащего полимер, со стадии (ii) на твердую фазу, включающую твердую матрицу-основание, содержащую лиганды, которые содержат гидрофобную часть, для получения адсорбции интересующей аспарагиновой протеазы на лиганде; и

(B): элюирование интересующей аспарагиновой протеазы с твердой фазы для извлечения аспарагиновой протеазы и получение, таким образом, очищенного выделенного интересующего молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы.

9. Способ по п. 6, где стадии (i)-(iii) в п. 6 включают:

(i): нанесение образца на водной основе, состоящего из ряда компонентов, включающих аспарагиновую протеазу, со стадии (i) в п. 6 на твердую фазу, включающую твердую матрицу-основание, содержащую лиганды, которые содержат гидрофобную часть, для получения адсорбции интересующей аспарагиновой протеазы на лиганде;

(ii): добавление полимера со стадии (ii) в п. 6 представляет собой добавление к элюирующему буферу; и

(iii): стадия выделения (iii) в п. 6 включает элюирование интересующей аспарагиновой протеазы с твердой фазы для извлечения аспарагиновой протеазы и получение, таким образом, очищенного выделенного интересующего молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы.

10. Способ выделения молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы по п. 6,

где молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза представляет собой химозин Camelius dromedarius, содержащий полипептидную аминокислотную последовательность, представленную на Фиг. 5 в настоящем документе (названную "Camel_chymosin"), или вариант химозина Camelius dromedarius, содержащий полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% (предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99%) идентичностью последовательности с полипептидной аминокислотной последовательностью верблюжьего химозина, представленной на Фиг. 5 в настоящем документе; или

где молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза представляет собой бычий пепсин, содержащий полипептидную аминокислотную последовательность, представленную на Фиг. 5 в настоящем документе (названную "Cow_pepsin") или вариант бычьего пепсина, содержащий полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% (предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99%) идентичностью последовательности с полипептидной аминокислотной последовательностью бычьего пепсина, представленной на Фиг. 5 в настоящем документе.

11. Способ выделения молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы по п. 6, где полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливинилполипирролидон, поливиниловый спирт, поливинилацетат, полиакрилонитрил, полиакрилат, полиметакрилат, полисорбат или Бридж 35.

12. Способ выделения молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы по п. 11, где полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисорбат 20 или Бридж 35, и где ПЭГ имеет молекулярную массу от 5000 г/моль до 15000 г/моль.

13. Композиция молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы по п. 1 или 2,

где молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза представляет собой химозин Camelius dromedarius, содержащий полипептидную аминокислотную последовательность, представленную на Фиг. 5 в настоящем документе (названную "Camel_chymosin"), или вариант химозина Camelius dromedarius, содержащий полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% (предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99%) идентичностью последовательности с полипептидной аминокислотной последовательностью верблюжьего химозина, представленной на Фиг. 5 в настоящем документе; или

где молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза представляет собой бычий пепсин, содержащий полипептидную аминокислотную последовательность, представленную на Фиг. 5 в настоящем документе (названную "Cow_pepsin"), или вариант бычьего пепсина, содержащий полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% (предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99%) идентичностью последовательности с полипептидной аминокислотной последовательностью бычьего пепсина, представленной на Фиг. 5 в настоящем документе.

14. Композиция молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы по п. 1 или 2, где полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливинилполипирролидон, поливиниловый спирт, поливинилацетат, полиакрилонитрил, полиакрилат, полиметакрилат, полисорбат или Бридж 35.

15. Композиция молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы по п. 14, где полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисорбат 20 или Бридж 35, и где ПЭГ имеет молекулярную массу от 5000 г/моль до 15000 г/моль.

16. Композиция молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы по п. 1, или 2, или 15,

где активность фермента согласно абзацу (i) составляет от 100 IMCU/г композиции до 10000 IMCU/г композиции; и

где концентрация полимера согласно абзацу (ii) составляет от 100 млн^-1 до 3000 млн^-1 (масс./масс.); и

где соль выбрана из группы NaCl, KCl, Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄, Na₂HPO₄ или NaH₂PO₄ или их комбинации; и

- где удельная активность молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы выше 300 IMCU/мг общего белка молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы, где молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза представляет собой химозин Camelius dromedarius, содержащий полипептидную аминокислотную последовательность, представленную на Фиг. 5 в настоящем документе (названную "Camel_chymosin"), или вариант химозина Camelius dromedarius, содержащий полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% (предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99%) идентичностью последовательности с полипептидной аминокислотной последовательностью верблюжьего химозина, представленной на Фиг. 5 в настоящем документе; или

- где удельная активность молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы выше 150 IMCU/мг общего белка молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы, где молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза представляет собой бычий химозин, содержащий полипептидную аминокислотную последовательность, представленную на Фиг. 5 в настоящем документе (названную "Cow_chymosin"), или вариант бычьего химозина, содержащий полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% (предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99%) идентичностью последовательности с полипептидной аминокислотной последовательностью верблюжьего химозина, представленной на Фиг. 5 в настоящем документе; и

где если композиция представляет собой жидкую композицию, то эта жидкая композиция имеет общую массу от 10 г до 10000 кг; и

где если композиция представляет собой сухую гранулированную композицию, то эта сухая гранулированная композиция имеет общую массу от 0,5 г до 50 кг.

17. Способ выделения молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы по п. 6,

где полимер добавляют на стадии (ii) в концентрации полимера от 100 млн^-1 до 4000 млн^-1 (масс./масс.); и

где полученный на стадии (iii) выделенный молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза обладает чистотой по меньшей мере 60% масс./масс. общего белка (то есть 60% масс./масс. общего белка в выделенной композиции составляет выделенный свертывающий фермент аспарагиновая протеаза); и

где полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливинилполипирролидон, поливиниловый спирт, поливинилацетат, полиакрилонитрил, полиакрилат, полиметакрилат или Бридж 35; и

где, когда полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливинилполипирролидон, поливиниловый спирт, поливинилацетат, полиакрилонитрил, полиакрилат или полиметакрилат, этот полимер представляет собой полимер с молекулярной массой от 2000 г/моль до 30000 г/моль; и

где выделенный на стадии (iii) молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза представляет собой фермент, который:

- обладает удельной активностью молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы выше 300 IMCU/мг общего белка молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы, более предпочтительно обладает удельной активностью молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы выше 350 IMCU/мг общего белка молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы, где молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза представляет собой химозин Camelius dromedarius, содержащий полипептидную аминокислотную последовательность, представленную на Фиг. 5 в настоящем документе (названную "Camel_chymosin"), или вариант химозина Camelius dromedarius, содержащий полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% (предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99%) идентичностью последовательности с полипептидной аминокислотной последовательностью верблюжьего химозина, представленной на Фиг. 5 в настоящем документе; или

- обладает удельной активностью молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы выше 150 IMCU/мг общего белка молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы, более предпочтительно обладает удельной активностью молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы выше 165 IMCU/мг общего белка молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы, где молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза представляет собой бычий химозин, содержащий полипептидную аминокислотную последовательность, представленную на Фиг. 5 в настоящем документе (названную "Cow_chymosin"), или вариант бычьего химозина, содержащий полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% (предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99%) идентичностью последовательности с полипептидной аминокислотной последовательностью бычьего химозина, представленной на Фиг. 5 в настоящем документе; и

где образец на водной основе, состоящий из ряда компонентов, включающих аспарагиновую протеазу, со стадии (i) получают путем рекомбинантного продуцирования молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы в продуцирующей клетке-хозяине (например в эукариотической продуцирующей клетке-хозяине, такой как клетка Aspergillus); и

где способ выделения интересующего молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы выполняют путем использования по меньшей мере одной методики очистки, выбранной из группы, состоящей из: хроматографии, колоночной хроматографии, адсорбции на слое, адсорбции в расширенном слое (ЕВА), периодической адсорбции, адсорбции на мембране и ионообменной хроматографии (IEC).

18. Способ выделения молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы по любому из пп. 8-12 или 17,

где полимер на стадии (ii) добавляют в концентрации полимера от 100 млн^-1 до 4000 млн^-1 (масс./масс.); и

где полученный на стадии (iii) выделенный молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза обладает чистотой по меньшей мере 60% масс./масс. общего белка (то есть 60% масс./масс. общего белка в выделенной композиции составляет выделенный свертывающий фермент аспарагиновая протеаза); и

где полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой от 5000 г/моль до 15000 г/моль или Бридж 35; и

где выделенный на стадии (iii) молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза представляет собой фермент, который:

- обладает удельной активностью молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы выше 300 IMCU/мг общего белка молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы, более предпочтительно обладает удельной активностью молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы выше 350 IMCU/мг общего белка молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы, где молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза представляет собой химозин Camelius dromedarius, содержащий полипептидную аминокислотную последовательность, представленную на Фиг. 5 в настоящем документе (названную "Camel_chymosin"), или вариант химозина Camelius dromedarius, содержащий полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% (предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99%) идентичностью последовательности с полипептидной аминокислотной последовательностью верблюжьего химозина, представленной на Фиг. 5 в настоящем документе; или

- обладает удельной активностью молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы выше 150 IMCU/мг общего белка молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы, более предпочтительно обладает удельной активностью молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы выше 165 IMCU/мг общего белка молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы, где молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза представляет собой бычий химозин, содержащий полипептидную аминокислотную последовательность, представленную на Фиг. 5 в настоящем документе (названную "Cow_chymosin"), или вариант бычьего химозина, содержащий полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% (предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99%) идентичностью последовательности с полипептидной аминокислотной последовательностью бычьего химозина, представленной на Фиг. 5 в настоящем документе; и

где образец на водной основе, состоящий из ряда компонентов, включающих аспарагиновую протеазу, со стадии (i) получают путем рекомбинантного продуцирования молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы в продуцирующей клетке-хозяине (например в эукариотической продуцирующей клетке-хозяине, такой как клетка Aspergillus); и

где способ выделения интересующего молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы выполняют путем использования по меньшей мере одной методики очистки, выбранной из группы, состоящей из: хроматографии, колоночной хроматографии, адсорбции на слое, адсорбции в расширенном слое (ЕВА), периодической адсорбции, адсорбции на мембране и ионообменной хроматографии (IEC); и

где гидрофобная часть лиганда представляет собой бензильную группу; и

где молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза представляет собой химозин Camelius dromedarius, содержащий полипептидную аминокислотную последовательность, представленную на Фиг. 5 в настоящем документе (названную "Camel_chymosin"), или вариант химозина Camelius dromedarius, содержащий полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% (предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99%) идентичностью последовательности с полипептидной аминокислотной последовательностью верблюжьего химозина, представленной на Фиг. 5 в настоящем документе; или где молокосвертывающий фермент аспарагиновая протеаза представляет собой бычий пепсин, содержащий полипептидную аминокислотную последовательность, представленную на Фиг. 5 в настоящем документе (названную "Cow_pepsin"), или вариант бычьего пепсина, содержащий полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% (предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99%) идентичностью последовательности с полипептидной аминокислотной последовательностью бычьего пепсина, представленной на Фиг. 5 в настоящем документе.