Экспрессия плазминогена и микроплазминогена в ряске - RU2006132394A

Реферат

1. Способ получения плазминогена в ряске, предусматривающий стадии

(a) культивирования растения ряски или клетки растения или клубенька ряски, где указанное растение ряски или клетка растения или клубенек ряски стабильно трансформированы молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую плазминоген; и

(b) сбора указанного плазминогена из указанных растения ряски или клетки растения или клубенька ряски.

2. Способ по п.1, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая плазминоген, функционально связана с кодирующей последовательностью для сигнального пептида, который направляет секрецию микроплазминогена в культуральную среду.

3. Способ по п.1, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая плазминоген, имеет по меньшей мере один признак, выбранный из группы, состоящей из

(a) предпочтительных для ряски кодонов в кодирующей последовательности для указанного плазминогена;

(b) функционально связанной нуклеотидной последовательности, содержащей интрон растения, которая встроена против хода транскрипции от кодирующей последовательности; и

(c) функционально связанной нуклеотидной последовательности, содержащей лидерную последовательность, которая увеличивает трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, кодирующей плазминоген.

4. Способ по п.3, где нуклеотидная последовательность, кодирующая плазминоген, содержит 70-100% предпочтительных для ряски кодонов.

5. Способ по п.3, где указанный интрон растения происходит из гена алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы.

6. Способ по п.5, где указанный интрон растения состоит, по существу, из последовательности, представленной в SEQ ID NO:1.

7. Способ по п.3, где указанная лидерная последовательность происходит из гена малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы 5В Lemna gibba.

8. Способ по п.7, где указанная лидерная последовательность состоит, по существу, из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2.

9. Способ по п.3, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая плазминоген, является нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3.

10. Способ по п.1, где указанный плазминоген является плазминогеном человека.

11. Способ по п.10, где указанный плазминоген имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:4.

12. Способ по п.1, где по меньшей мере 2% растворимого белка в растении ряски или в клетке растения ряски являются плазминогеном.

13. Способ по п.12, где по меньшей мере 3% растворимого белка в растении ряски или в клетке растения ряски являются плазминогеном.

14. Способ по п.13, где по меньшей мере 4% растворимого белка в растении ряски или в клетке растения ряски являются плазминогеном.

15. Способ получения микроплазминогена в ряске, предусматривающий стадии

(a) культивирования в среде для культивирования ряски культуры растений ряски, культуры клеток растений или клубеньков ряски, где указанная культура растения ряски или культура клеток растений или клубеньков ряски стабильно трансформирована молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую микроплазминоген, и функционально связанную кодирующую последовательность для сигнального пептида, которая направляет секрецию микроплазминогена в культуральную среду; и

(b) сбора указанного микроплазминогена из культуральной среды ряски.

16. Способ по п.15, где указанный микроплазминоген секретируется в культуральную среду ряски.

17. Способ по п.16, где указанная культуральная среда ряски содержит по меньшей мере 1 мг/л микроплазминогена, как определено количественным Вестерн-блоттингом.

18. Способ по п.16, где указанная культуральная среда ряски содержит по меньшей мере 2 мг/л микроплазминогена, как определено количественным Вестерн-блоттингом.

19. Способ по п.16, где указанная культуральная среда ряски содержит по меньшей мере 5 мг/л микроплазминогена, как определено количественным Вестерн-блоттингом.

20. Способ по п.19, где указанная культуральная среда ряски содержит по меньшей мере 10 мг/л микроплазминогена, как определено количественным Вестерн-блоттингом.

21. Способ по п.15, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая микроплазминоген, и функционально связанная кодирующая последовательность для сигнального пептида имеет по меньшей мере один признак, выбранный из группы, состоящей из

(а) предпочтительных для ряски кодонов в кодирующей последовательности для указанного микроплазминогена;

(b) предпочтительных для ряски кодонов в кодирующей последовательности для указанного сигнального пептида;

(c) функционально связанной нуклеотидной последовательности, содержащей интрон растения, которая встроена против хода транскрипции от кодирующей последовательности; и

(d) функционально связанной нуклеотидной последовательности, содержащей лидерную последовательность, которая увеличивает трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, кодирующей микроплазминоген.

22. Способ по п.21, где нуклеотидная последовательность, кодирующая микроплазминоген, содержит 70-100% предпочтительных для ряски кодонов.

23. Способ по п.22, где нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, содержит 70-100% предпочтительных для ряски кодонов.

24. Способ по п.21, где указанный интрон растения происходит из гена алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы.

25. Способ по п.24, где указанный интрон растения состоит, по существу, из последовательности, представленной в SEQ ID NO:1.

26. Способ по п.21, где указанная лидерная последовательность происходит из гена малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы 5В Lemna gibba.

27. Способ по п.26, где указанная лидерная последовательность состоит, по существу, из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2.

28. Способ по п.21, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая микроплазминоген, является нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:5.

29. Способ по п.15, где указанный микроплазминоген является микроплазминогеном человека.

30. Способ по п.29, где указанный микроплазминоген имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:4.

31. Способ по п.15, где указанный сигнальный пептид является полипептидом альфа-амилазы риса.

32. Способ по п.31, где кодирующая последовательность для сигнального пептида содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7.

33. Способ по п.15, где указанная последовательность сигнального пептида имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8.

34. Способ по п.1, где указанные растение ряски или клетка растения ряски происходят из рода, выбранного из группы, состоящей из рода Spirodela, рода Wolffia, рода Wolfiella, рода Landoltia и рода Lemna.

35. Способ по п.15, где указанные растение ряски или клетка растения ряски принадлежат к роду, выбранному из группы, состоящей из рода Spirodela, рода Wolffia, рода Wolfiella, рода Landoltia и рода Lemna.

36. Усовершенствованный способ получения стабильного плазминогена, предусматривающий получение плазминогена способом по п.1.

37. Способ получения фрагмента плазминогена в ряске, предусматривающий стадии

(a) культивирования в среде для культивирования ряски растения ряски или клетки растения или клубенька ряски, где указанные растение ряски или клетка растения или клубенек ряски стабильно трансформированы молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент плазминогена; и

(b) сбора указанного фрагмента плазминогена из по меньшей мере одного источника, выбранного из указанного растения ряски, указанной клетки растения ряски, указанного клубенька ряски или указанной культуральной среды ряски.

38. Способ по п.37, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент плазминогена, функционально связана с кодирующей последовательностью для сигнального пептида, который направляет секрецию микроплазминогена в культуральную среду.

39. Способ по п.37, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент плазминогена, имеет по меньшей мере мере один признак, выбранный из группы, состоящей из

(a) предпочтительных для ряски кодонов в кодирующей последовательности для указанного фрагмента плазминогена;

(b) функционально связанной нуклеотидной последовательности, содержащей интрон растения, которая встроена против хода транскрипции от кодирующей последовательности; и

(c) функционально связанной нуклеотидной последовательности, содержащей лидерную последовательность, которая увеличивает трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент плазминогена.

40. Способ по п.39, где нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент плазминогена, содержит 70-100% предпочтительных для ряски кодонов.

41. Способ по п.39, где указанный интрон растения происходит из гена алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы.

42. Способ по п.37, где указанный фрагмент плазминогена содержит по меньшей мере 80 смежных аминокислот аминокислотной последовательности зрелого плазминогена.

43. Стабильно трансформированные растение ряски, клетка растения или клубенек ряски в соответствии с п.1.

44. Стабильно трансформированные растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски по п.43, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски происходят из рода, выбранного из группы, состоящей из рода Spirodela, рода Wolffia, рода Wolfiella, рода Landoltia и рода Lemna.

45. Стабильно трансформированные растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски по п.44, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски является членом вида, выбранного из группы, состоящей из Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis, и Lemna gibba.

46. Стабильно трансформированные растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски в соответствии с п.15.

47. Стабильно трансформированные растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски по п.46, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски происходят из рода, выбранного из группы, состоящей из рода Spirodela, рода Wolffia, рода Wolfiella, рода Landoltia и рода Lemna.

48. Стабильно трансформированные растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски по п.47, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски является членом вида, выбранного из группы, состоящей из Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis, и Lemna gibba.

49. Стабильно трансформированные растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски в соответствии с п.37.

50. Стабильно трансформированные растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски по п.49, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски происходят из рода, выбранного из группы, состоящей из рода Spirodela, рода Wolffia, рода Wolfiella, рода Landoltia и рода Lemna.

51. Стабильно трансформированные растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски по п.50, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски является членом вида, выбранного из группы, состоящей из Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis, и Lemna gibba.

52. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

(a) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:4;

(b) аминокислотной последовательности варианта последовательности плазминогена, показанной в SEQ ID NO:4, где указанный вариант имеет по меньшей мере 95% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:6;

(c) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:6; и

(d) аминокислотной последовательности варианта последовательности микроплазминогена, показанной в SEQ ID NO:6, где указанный вариант имеет по меньшей мере 95% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:6;

причем указанная нуклеотидная последовательность содержит 70-100% предпочтительных для ряски кодонов.

53. Молекула нуклеиновой кислоты по п.49, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

(a) нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3; и

(b) нуклеотидной последовательности, представленной с SEQ ID NO:5.

54. Стабильно трансформированное растение ряски, где указанная ряска содержит ДНК-конструкцию, содержащую следующие функционально связанные элементы: лидерную последовательность, промоторную последовательность, нуклеотидную последовательность, кодирующую плазминоген, и последовательность терминации транскрипции, где указанная лидерная последовательность, указанная промоторная последовательность и указанная последовательность терминации, - все функционируют в ряске.

55. Растение по п.54, где указанная лидерная последовательность является последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2, а последовательность, кодирующая плазминоген, представлена в SEQ ID NO:3.