Клетки мицелиальных грибов с множественной недостаточностью протеаз и способы их использования - RU2016104064A
Код документа: RU2016104064A
Формула
1. Клетка мицелиального гриба, содержащая по меньшей мере одну эндогенную протеазу, обладающую сниженной протеазной активностью или не обладающую протеазной активностью, и рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий гетерологичный полипептид, где клетка обладает пониженной протеазной активностью или не обладает протеазной активностью одной или более следующих протеаз: amp2, mp1, mp2, mp3, mp4, mp5, pep9, amp1 и sep1.
2. Клетка мицелиального гриба по п. 1, где клетка гриба представляет собой клетку Trichoderma fungal, клетку гриба Myceliophthora, клетку гриба Aspergillus, клетку гриба Neurospora, клетку Penicillium, клетку Fusarium или клетку гриба Chrysosporium.
3. Клетка мицелиального гриба по п. 1, где общая протеазная активность является сниженной до 40% или менее, предпочтительно 6% или менее от общей протеазной активности соответствующей родительской клетки мицелиального гриба, в которой протеазы не обладают сниженной активностью.
4. Клетка мицелиального гриба по п. 1, где клетка дополнительно обладает сниженной или недетектируемой протеазной активностью по меньшей мере трех или четырех протеаз, выбранных из группы, состоящей из pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, pep8, pep11, pep12, tsp1, slp1, slp2, slp3, slp7, gap1 и gap2.
5. Клетка мицелиального гриба по п. 1, где клетка обладает сниженной или недетектируемой протеазной активностью по меньшей мере восьми протеаз, где каждый из генов, кодирующих восемь протеаз, содержит мутацию, которая приводит к снижению или подавлению соответствующей протеазной активности, и восемь протеазы представляют собой:
a. pep1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3, pep5, amp2
b. pep1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3, pep5, amp1,
c. pep1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3, pep5, sep1
d. pep1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3, pep5, pep9 или
e. pep1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3, pep5, pep2.
6. Клетка мицелиального гриба по п. 1, где клетка обладает сниженной протеазной активностью или не обладает протеазной активностью по меньшей мере девяти протеаз, где каждый из генов, кодирующих девять протеаз, содержит мутацию, которая приводит к снижению или подавлению соответствующей протеазной активности, и девять протеаз представляют собой pep1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3, pep5, pep2, sep1.
7. Клетка мицелиального гриба по п. 1, где клетка обладает сниженной протеазной активностью или не обладает протеазной активностью по меньшей мере десяти протеаз, где каждый из генов, кодирующих десять протеаз, содержит мутацию, которая приводит к снижению или подавлению соответствующей протеазной активности, и десять протеазы представляют собой pep1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3, pep5, pep2, sep1, slp8.
8. Клетка мицелиального гриба по п. 1, где клетка обладает сниженной протеазной активностью или не обладает протеазной активностью по меньшей мере одиннадцати протеаз, где каждый из генов, кодирующих одиннадцать протеаз, содержит мутацию, которая приводит к снижению или подавлению соответствующей протеазной активности, и одиннадцать протеазы представляют собой pep1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3, pep5, pep2, sep1, slp8, amp2.
9. Клетка мицелиального гриба по п. 1, где:
(i) клетка обладает пониженной протеазной активностью или не обладает протеазной активностью по меньшей мере двенадцати протеаз, где кажд ый из генов, кодирующих двенадцать протеаз, содержит мутацию, которая приводит к снижению или подавлению соответствующей протеазной активности, и двенадцать протеаз представляют собой pep1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3, pep5, pep2, sep1, slp8, amp2, slp7;
(ii) клетка обладает пониженной протеазной активностью или не обладает протеазной активностью по меньшей мере тринадцати протеаз, где каждый из генов, кодирующих тринадцать протеаз, содержит мутацию, которая приводит к снижению или подавлению соответствующей протеазной активности, и тринадцать протеазы представляют собой:
- pep1, tsp1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3, pep5, pep2, sep1, slp8, amp2, pep9;
- pep1, tsp1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3, pep5, pep2, sep1, slp8, amp2, slp7 или
- pep1, tsp1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3, pep5, pep2, sep1, slp8, amp2, slp3;
(iii)клетка обладает пониженной протеазной активностью или не обладает протеазной активностью по меньшей мере четырнадцати протеаз, где каждый из генов, кодирующих четырнадцать протеаз, содержит мутацию, которая приводит к снижению или подавлению соответствующей протеазной активности, и четырнадцать протеаз представляют собой pep1 tsp1 slp1 gap1 gap2 pep4 pep3 pep5 pep2 sep1 slp8 amp2 pep9 slp2; или
(iv) клетка обладает пониженной протеазной активностью или не обладает протеазной активностью по меньшей мере пятнадцати протеаз, где каждый из генов, кодирующих пятнадцать протеаз, содержит мутацию, которая приводит к снижению или подавлению соответствующей протеазной активности, и пятнадцать протеаз представляют собой:
- pep1 tsp1 slp1 gap1 gap2 pep4 pep3 pep5 pep2 sep1 slp8 amp2 pep9 slp2 mp1 или
- pep1 tsp1 slp1 gap1 gap2 pep4 pep3 pep5 pep2 sep1 slp8 amp2 pep9 slp2 mp5.
10. Клетка мицелиального гриба по п. 9, где клетка обладает пониженной протеазной активностью или не обладает протеазной активностью по меньшей мере шестнадцати, по меньшей мере семнадцати, по меньшей мере восемнадцати, по меньшей мере девятнадцати или по меньшей мере двадцати или более протеаз, дополнительно содержащих по меньшей мере одну или более дополнительных мутации, где каждая дополнительная мутация приводит к снижению или подавлению соответствующей дополнительной протеазной активности, и указанная по меньшей мере дополнительная протеаза выбрана из группы, состоящей из:
- аспарагиновой протеазы pep6, pep10, pep13, pep14 или pep16;
- slp-подобной протеазы slp57433, slp35726, slp60791 или slp109276;
- gap-подобной протеазы gap3 или gap4;
- седолизиноподобной протеазы sed2, sed3 или sed5;
- протеазы группы A, выбранной из группы: протеаза65735, протеаза77577, протеаза81087, протеаза56920, протеаза122083, протеаза79485, протеаза120998 или протеаза61127;
- протеазы группы B, выбранной из группы: протеаза21659, протеаза58387, протеаза75159, протеаза56853 или протеаза64193;
- протеазы группы C, выбранной из группы: протеаза82452, протеаза80762, протеаза21668, протеаза81115, протеаза82141, протеаза23475;
- протеазы группы D, выбранной из группы: протеаза121890, протеаза22718, протеаза47127, протеаза61912, протеаза80843, протеаза66608, протеаза72612, протеаза40199; или
- протеазы группы E, выбранной из группы: протеаза22210, протеаза111694, протеаза82577.
11. Клетка мицелиального гриба по п. 1, где полипептид млекопитающего выбран из группы, состоящей из антитела и его антигенсвязывающих фрагментов, фактора роста, интерферона, цитокина и интерлейкина.
12. Клетка мицелиального гриба по п. 1, где клетка гриба дополнительно содержит ATG3, обладающий сниженной активностью.
13. Клетка мицелиального гриба по п. 12, где ген, кодирующий ATG3, содержит мутацию которая приводит к снижению или подавлению соответствующей активности.
14. Клетка мицелиального гриба по п. 1, дополнительно содержащая каталитический домен N-ацетилглюкозамилтрансферазы I и необязательно каталитический домен N-ацетилглюкозамилтрансферазы II.
15. Способ повышения стабильности полипептида, включающий:
a) предоставление клетки мицелиального гриба по любому из предшествующих пунктов и
b) культивирование клетки, таким образом, что экспрессируется гетерологичный полипептид,
где гетерологичный полипептид обладает повышенной стабильностью по сравнению с гетерологичным полипептидом, продуцируемым в соответствующей родительской клетке мицелиального гриба, в которой протеазы не обладают сниженной активностью.
16. Способ получения гетерологичного полипептида, включающий:
a) предоставление клетки мицелиального гриба по любому из пп. 1-14,
b) культивирование клетки, таким образом, что экспрессируется гетерологичный полипептид, и
c) очистку гетерологичного полипептида.
