Новая термостабильная тагатоза-6-фосфатфосфатаза и способ получения тагатозы с ее использованием - RU2722208C1

Чертежи

Описание

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к тагатозо-6-фосфатфосфатазе и к способу получения тагатозы с ее применением.

Предшествующий уровень техники

Способ получения D-тагатозы из D-галактозы посредством использования изомеразы L-арабинозы и способ получения тагатозы из D-фруктозы посредством использования L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразы были описаны, как способы получения тагатозы с помощью обычной одноферментной реакции превращения. Однако в такой одноферментной реакции превращения имеется определенный уровень равновесия реакции между субстратом и продуктом (продукт/субстрат = примерно 20% - 50%). Следовательно, в случае получения тагатозы высокой чистоты с использованием одноферментной реакции превращения требуется дополнительный процесс очистки для выделения и удаления высокой концентрации субстрата из продукта реакции.

С другой стороны, для способа получения D-тагатозы с использованием многоферментной реакции превращения уже описан (корейские патенты 10-1627921 и 10-1620904) способ получения, включающий получение D-фруктозо-6-фосфата из аденозинтрифосфата (АТР) и фруктозы путем использования гексокиназы (ЕС 2.7.1.1), превращение D-фруктозо-6-фосфата в D-тагатозо-6-фосфат путем использования D-фруктозо-1,6-бисфосфатадолазы (ЕС 4.1.2.13), имеющей активность фруктозо-6-фосфат-4-эпимеразы, и получение D-тагатозы из D-тагатозо-6-фосфата путем использования фитазы в качестве фосфатазы. Однако для многоферментной реакции требуется дорогостоящая АТФ в качестве донора фосфата и эта реакция ограничена в применимости способа из-за низкой физико-химической стабильности (нагрев, рН и т.д.) адениннуклеотидов АМФ, АДФ и АТФ. Кроме того, фитазы индуцируют необратимые реакции в связи с разнообразием их субстратов и, таким образом, ограничены в повышении выхода тагатозы.

Техническая задача

Авторы настоящего изобретения выполнили большой объем работ для разработки способа получения тагатозы с высоким выходом при использовании дешевого сырья. В результате, когда тагатозо-6-фосфат образуется в результате превращения из сахарозы, крахмала или мальтодекстрина, которые являются дешевым сырьем, в глюкозу или глюкозо-1-фосфат, глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат, было обнаружено, что тагатоза может быть получена посредством однореакторных ферментативных превращений, где множество ферментов, вовлеченных в путь получения тагатозы, можно использовать одновременно, путем осуществления дефосфорилирования тагатозо-6-фосфата, в качестве необратимой реакции с использованием тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению; и при этом уровень превращения в тагатозу может быть значительно увеличен, и тем самым осуществлено настоящее изобретение.

Техническое решение

Целью настоящего изобретения является предложение

тагатозо-6-фосфатфосфатазы, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

Другой целью настоящего изобретения является предложение нуклеиновой кислоты, кодирующей тагатозо-6-фосфатфосфатазу по настоящему изобретению.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение трансформанта, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую тагатозо-6-фосфатфосфатазу по настоящему изобретению.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение композиции для получения тагатозы, содержащей тагатозо-6-фосфатфосфатазу по настоящему изобретению, микроорганизм, экспрессирующий тагатозо-6-фосфатфосфатазу, или культуру микроорганизма, экспрессирующего тагатозо-6-фосфатфосфатазу.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение способа получения тагатозы с использованием тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению.

Полезные эффекты

Поскольку тагатозо-6-фосфатфосфатаза по настоящему изобретению является термостабильной, ее можно использовать для промышленного производства тагатозы, получение тагатозы в высокой концентрации возможно при использовании пути с необратимой реакцией, и тагатозу можно получать с помощью однореакторного ферментативного превращения путем использовании в качестве сырья сахарозы, крахмала или мальтодекстрина, которые являются дешевым сырьем. Следовательно, поскольку способ получения тагатозы высокой чистоты может быть упрощен, этот способ получения имеет преимущество в том, что он является и простым, и экономичным.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 схематически показан реакционный путь, способный производить тагатозу из крахмала (например мальтодекстрина), сахарозы или глюкозы, и показаны участвующие в реакции ферменты.

На Фиг. 2 показаны результаты анализа молекулярной массы тагатозо-6-фосфатфосфатазы (Е: Т6РР) по настоящему изобретению посредством электрофореза белков в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). "М" представляет собой маркер размера белка и "СЕ" представляет супернатант после разрушения трансформанта.

На Фиг. 3 представлен график, показывающий активность тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению в превращении тагатозо-6-фосфата в тагатозу.

На Фиг. 4 представлен график, показывающий активность тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению в зависимости от буферного раствора и диапазона рН.

На Фиг. 5 представлен график, показывающий активность тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению в зависимости от температуры.

На Фиг. 6 представлен график, показывающий активность тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению при добавлении иона металла.

На Фиг. 7 представлен график, показывающий субстратную специфичность тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению в отношении тагатозо-6-фосфата.

Лучший вариант осуществления изобретения

Ниже настоящее изобретение описано более подробно. При этом каждое из пояснений и типичных воплощений, раскрытых в данном описании изобретения, может быть применено к другим пояснениям и типичным воплощениям. Таким образом, все комбинации различных факторов, раскрытых в данном описании изобретения, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не следует ограничивать конкретным раскрытием, представленным ниже.

Для достижения цели настоящего изобретения в одном аспекте настоящего изобретения предлагается тагатозо-6-фосфатфосфатаза, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

Тагатозо-6-фосфатфосфатаза по настоящему изобретению может содержать полипептид, имеющий гомологию с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, составляющую по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 97% или 99%. Например, очевидно, что белок, имеющий аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением некоторых последовательностей, входит в объем настоящего изобретения, пока он обладает гомологией и проявляет эффективность, соответствующую эффективности белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

Кроме того, когда белок обладает эффективностью, соответствующей эффективности тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению, которая состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, он не исключает мутации, которая может образоваться при добавлении бессмысленной последовательности выше или ниже аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, природной мутации или молчащей мутации. Кроме того, белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, также входит в объем настоящего изобретения.

Кроме того, тагатозо-6-фосфатфосфатаза может кодироваться нуклеотидной последовательностью SED ID NO: 2, или тагатозо-6-фосфатфосфатаза может кодироваться нуклеотидной последовательностью, имеющей гомологию с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, составляющую по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 97%, или 99%, без ограничения ими. Исходя из вырожденности генетического кода, очевидно, что белки, которые состоят из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или полинуклеотиды, которые могут быть транслированы в белки, имеющие гомологию с вышеуказанными белками, также могут быть включены в объем настоящего изобретения.

При использовании здесь термин "гомология" относится к степени соответствия с данной аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью, и эта гомология может быть выражена в процентах. В настоящем описании гомология последовательности, имеющей активность, идентичную или подобную данной аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, выражена как "% гомологии". Гомология последовательности может быть определена, например, с помощью стандартного программного обеспечения, в частности программы BLAST 2.0, которая вычисляет такие параметры, как счет, идентичность, подобие и т.д., или путем сравнения последовательностей в эксперименте Саузерн-гибридизации в определенных жестких условиях, при этом определение подходящих условий гибридизации находится в компетенции специалистов в данной области и они могут быть определены способом, хорошо известным специалистам в данной области техники (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). При использовании здесь термин "жесткие условия" относится к условиям, которые предназначены для обеспечения специфичной гибридизации между полинуклеотидами. Например, эти условия конкретно описаны в литературе (например в J. Sambrook et al., см. выше).

В настоящем описании изобретения жесткие условия могут быть подобраны для определения гомологии. Чтобы подтвердить гомологию полинуклеотидов, можно использовать условия гибридизации низкой жесткости, соответствующей значению T_m 55°С. Например, можно использовать условия 5Х SSC (смесь хлорида и цитрата натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), 0,25% молока и без формамида; или 30% формамида, 5Х SSC и 0,5% SDS. Можно использовать условия гибридизации умеренной жесткости, соответствующие высоким значениями T_m; например 40% формамида и 5Х или 6Х SSC. Можно использовать условия гибридизации, соответствующие высоким значениям T_m; например 50% формамида и 5Х или 6Х SSC, но условия гибридизации не ограничены приведенными выше примерами.

Для гибридизация требуется, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя возможны несоответствия между основаниями в зависимости от жесткости гибридизации. Термин "комплементарный" используется для описания отношений между нуклеотидными основаниями, которые способны к гибридизации друг с другом. Например, в отношении ДНК, аденозин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Следовательно, настоящее изобретение может также включать по существу подобные нуклеиновокислотные последовательности, а также выделенные фрагменты нуклеиновой кислоты, комплементарные всей последовательности.

Конкретно, полинуклеотид, имеющий гомологию, может быть определен с использованием условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при значении T_m 55°С и с использованием вышеописанных условий. Кроме того, значение T_m может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничено ими. Специалисты в данной области техники могут подходящим образом подобрать значение T_m в соответствии с целью.

Подходящая жесткость гибридизации полинуклеотидов зависит от длины и степени комплементарности полинуклеотидов, и переменные хорошо известны в данной области. По мере увеличения подобия или гомологии двух нуклеотидов, значение T_m для гибридов этих полинуклеотидов, имеющих такую последовательность, увеличивается. Относительная стабильность при гибридизации полинуклеотидов (соответствующая более высокому значению T_m) уменьшается в следующем порядке: РНК:РНК, ДНК:РНК, ДНК:ДНК. Формула расчета значений T_m для гибридов, длина которых превышает 100 нуклеотидов, опубликована в уровне техники (Sambrook et al., см. выше, 9.50-9.51). Для гибридизации более коротких полинуклеотидов, например олигонуклеотидов, несовпадающее положение может быть более важным и длина олигонуклеотидов может определять их специфичность (Sambrook et al., см. выше, 11.7-11.8).

В частности, полинуклеотиды могут быть обнаружены с использованием следующих условий гибридизации: 1) стадия гибридизации с концентрацией соли ниже 500 мМ и температурой по меньшей мере 37°С; и стадия промывки 2Х SSPE при по меньшей мере 63°С; 2) стадия гибридизации с концентрацией соли ниже 200 мМ и температурой по меньшей мере 37°С; или 3) обе стадии гибридизации и промывки при 63°С с 2Х SSPE.

Длина гибридизационной нуклеиновой кислоты может составлять, например, по меньшей мере примерно 10 нуклеотидов, 15 нуклеотидов, 20 нуклеотидов или по меньшей мере 30 нуклеотидов. Кроме того, специалисты в данной области техники могут подобрать температуру и концентрацию соли в промывочном растворе по мере необходимости в зависимости от таких факторов, как длина зонда.

Тагатозо-6-фосфатфосфатаза по настоящему изобретению может представлять собой фермент, полученный из Thermotoga sp., и, в частности, может представлять собой фермент, полученный из Thermotoga neapolitana, но не ограничивается этим.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается нуклеиновая кислота, кодирующая тагатозо-6-фосфатфосфатазу по настоящему изобретению.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен трансформант, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую тагатозо-6-фосфатфосфатазу по настоящему изобретению.

При использовании здесь термин "трансформация" относится к процессу введения в клетку-хозяина вектора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую целевой белок, и тем самым обеспечения экспрессии белка, кодируемого этой нуклеиновой кислотой в клетке-хозяине. Для трансформирующей нуклеиновой кислоты не имеет значения, встроена ли эта трансформирующая нуклеиновая кислота в хромосому клетки-хозяина и расположена в ней, или она расположена вне хромосомы, при условии, что она может экспрессироваться в клетке-хозяине, и оба случая включены в настоящее изобретение. Кроме того, нуклеиновая кислота включает ДНК и РНК, которые кодируют целевой белок. Нуклеиновая кислота может быть вставлена в любой форме, в которой она может быть введена в клетку-хозяина и экспрессирована в ней. Например, нуклеиновая кислота может быть введена в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, включающую все существенные элементы, необходимые для собственной экспрессии. Экспрессионная кассета может, как правило, включать промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, сигнал терминации транскрипции, домен, связывающий рибосому, и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может находиться в форме экспрессионного вектора, способного к саморепликации. Кроме того, нуклеиновая кислота может быть введена в клетку-хозяина, как есть, и функционально связана с последовательностью, необходимой для ее экспрессии в клетке-хозяине, но нуклеиновая кислота не ограничена этим.

Кроме того, при использовании здесь, термин "функционально связанный" относится к функциональной связи между последовательностью промотора, который инициирует и опосредует транскрипцию нуклеиновой кислоты, кодирующей целевой белок по настоящему изобретению и вышеуказанной последовательностью гена.

Способ по настоящему значению для трансформации вектора включает любой метод введения нуклеиновой кислоты в клетку и может быть осуществлен путем выбора подходящей стандартной методики, известной в данной области техники, в соответствии с клеткой-хозяином. Примеры способа могут включать электропорацию, осаждение фосфатом кальция (СаРО₄), осаждение хлоридом кальция (CaCl₂), микроинъекцию, метод с использованием полиэтиленгликоля (PEG), метод DEAE-декстрана, метод катионных липосом, метод ацетат лития-ДМСО и т.д., но не ограничены ими.

В качестве клетки-хозяина предпочтительно использовать хозяина, обладающего высокой эффективностью по введению ДНК и высокой эффективностью экспрессии введенной ДНК. Например, это может быть Е. coli, без ограничения им.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается композиция для получения тагатозы, содержащая тагатозо-6-фосфатфосфатазу по настоящему изобретению, микроорганизм, экспрессирующий тагатозо-6-фосфатфосфатазу, или культура микроорганизма, экспрессирующего тагатозо-6-фосфатфосфатазу.

Композиция для получения тагатозы может дополнительно содержать фермент, участвующий в пути продуцирования тагатозы (см. Фиг. 1) по настоящему изобретению, микроорганизм, экспрессирующий фермент, участвующий в пути продуцирования тагатозы по настоящему изобретению, или культуру микроорганизма, экспрессирующего фермент, участвующий в пути продуцирования тагатозы по настоящему изобретению. Однако это всего лишь пример; то есть фермент, который должен содержаться в композиции по настоящему изобретению для получения тагатозы, и субстрат, используемый для получения тагатозы, не ограничены, при условии, что тагатоза может быть получена с использованием тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению.

Композиция по настоящему изобретению для получения тагатозы может дополнительно содержать: (а) (1) крахмал, мальтодекстрин, сахарозу или их комбинацию, глюкозу, глюкозо-1-фосфат, глюкозо-6-фосфат, фруктозо-6-фосфат или тагатозо-6-фосфат; (2) фосфат; (3) фруктозо-6-фосфат-4-эпимеразу; (4) глюкозо-6-фосфатизомеразу; (5) фосфоглюкомутазу или глюкокиназу; и/или (6) α-глюканофосфорилазу, крахмалфосфорилазу, мальтодекстринфосфорилазу или сахарозафосфорилазу или α-амилазу, пуллуланазу, изоамилазу, глюкоамилазу или сахаразу; или (б) микроорганизм, экспрессирующий любой из указанных ферментов, или культуру указанного микроорганизма, но без ограничения ими.

Крахмал/мальтодекстринфосфорилазы (ЕС 2.4.1.1) и α-глюканофосфорилаза по настоящему изобретению могут включать любые белки при условии, что они являются белками, которые подвергаются переносу фосфорила от фосфата к глюкозе, и тем самым обладают активностью продуцирования глюкозо-1-фосфата из крахмала или мальтодекстрина. Сахарозафосфорилаза (ЕС 2.4.1.7) по настоящему изобретению может включать любой белок при условии, что он является белком, который подвергается переносу фосфорила от фосфата к глюкозе, и тем самым обладает активностью продуцирования глюкозо-1-фосфата из сахарозы. α-Амилаза (ЕС 3.2.1.1), пуллуланаза (ЕС 3.2.1.41), глюкоамилаза (ЕС 3.2.1.3), и изоамилаза по настоящему изобретению, которые представляют собой ферменты для осахаривания крахмала, могут включать любые белки при условии, что эти белки обладают активностью превращения крахмала или мальтодекстрина в глюкозу. Сахараза (ЕС 3.2.1.26) по настоящему изобретению может включать любой белок при условии, что этот белок обладает активностью превращения сахарозы в глюкозу. Фосфоглюкомутаза (ЕС 5.4.2.2) по настоящему изобретению может включать любой белок при условии, что этот белок обладает активностью превращения глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат. Глюкокиназа может включать любой белок при условии, что этот белок способен переносить фосфат на глюкозу и тем самым обладает активностью превращения в глюкозо-6-фосфат. В частности, глюкокиназа может быть полифосфат-зависимой глюкокиназой и, более конкретно, может быть полифосфат-зависимой глюкокиназой, происходящей из Deinococcus geothermalis, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 7, или может быть полифосфат-зависимой глюкокиназой, происходящей из Anaerolinea thermophila, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 8. Глюкозо-6-фосфатизомераза по настоящему изобретению может включать любой белок при условии, что этот белок обладает активностью превращения глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат. Фруктозо-6-фосфат-4-эпимераза по настоящему изобретению может включать любой белок при условии, что этот белок обладает активностью превращения фруктозо-6-фосфата в тагатозо-6-фосфат.

Композиция по настоящему изобретению для получения тагатозы может дополнительно содержать ион или соль металла, выбранного из группы, состоящей из Mg, Mn и Zn. В частности, соль металла по настоящему изобретению может представлять собой соль металла, выбранного из группы, состоящей из MgCl₂, MgSO₄, MnCl₂, MnSO₄, ZnCl₂ и ZnSO₄.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения тагатозы, включающий превращение тагатозо-6-фосфата в тагатозу посредством взаимодействия тагатозо-6-фосфата с тагатозо-6-фосфатфосфатазой по настоящему изобретению, микроорганизм, экспрессирующий тагатозо-6-фосфатфосфатазу, или культура микроорганизма, экспрессирующего тагатозо-6-фосфатфосфатазу.

Способ получения по настоящему изобретению может дополнительно включать превращение фруктозо-6-фосфата в тагатозо-6-фосфат посредством реакции фруктозо-6-фосфата с фруктозо-6-фосфат-4-эпимеразой, микроорганизм, экспрессирующий фруктозо-6-фосфат-4-эпимеразу, или культуру микроорганизма, экспрессирующего фруктозо-6-фосфат-4-эпимеразу, перед превращением тагатозо-6-фосфата в тагатозу.

Кроме того, способ получения может дополнительно включать превращение глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат посредством реакции глюкозо-6-фосфата с глюкозо-6-фосфатизомеразой, микроорганизм, экспрессирующий глюкозо-6-фосфатизомеразу, или культуру микроорганизма, экспрессирующего глюкозо-6-фосфатизомеразу, перед превращением фруктозо-6-фосфата по настоящему изобретению в тагатозо-6-фосфат.

Кроме того, способ получения может дополнительно включать превращение глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат посредством реакции глюкозо-1-фосфата с фосфоглюкомутазой, микроорганизм, экспрессирующий фосфоглюкомутазу, или культуру микроорганизма, экспрессирующего фосфоглюкомутазу, перед превращением глюкозо-6-фосфата по настоящему изобретению во фруктозо-6-фосфат.

Кроме того, способ получения может дополнительно включать превращение глюкозы в глюкозо-6-фосфат посредством реакции глюкозы с глюкокиназой, микроорганизм, экспрессирующий глюкокиназу, или культуру микроорганизма, экспрессирующего глюкокиназу, и фосфат, перед превращением глюкозо-6-фосфата по настоящему изобретению во фруктозо-6-фосфат.

Кроме того, способ получения может дополнительно включать превращение крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации в глюкозо-1-фосфат посредством взаимодействия крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации с фосфатом и α-глюканофосфорилазой, крахмалфосфорилазой, мальтодекстринфосфорилазой или сахарозафосфорилазой; микроорганизм, экспрессирующий α-глюканофосфорилазу, крахмалфосфорилазу, мальтодекстринфосфорилазу или сахарозафосфорилазу; или культуру микроорганизма, экспрессирующего α-глюканофосфорилазу,

крахмалфосфорилазу, мальтодекстринфосфорилазу или сахарозафосфорилазу, перед превращением глюкозо-1-фосфата по настоящему изобретению в глюкозо-6-фосфат.

Кроме того, способ получения может дополнительно включать превращение крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации в глюкозу посредством взаимодействия крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации с α-амилазой, пуллуланазой, глюкоамилазой, сахаразой или изоамилазой; микроорганизм, экспрессирующий α-амилазу, пуллуланазу, глюкоамилазу, сахаразу или изоамилазу; или культуру микроорганизма, экспрессирующего α-амилазу, пуллуланазу, глюкоамилазу, сахаразу или изоамилазу, перед превращением глюкозы по настоящему изобретению в глюкозо-6-фосфат.

Способ получения может дополнительно включать превращение глюкозы в крахмал, мальтодекстрин или сахарозу посредством реакции глюкозы с 4-α-глюкантрансферазой, микроорганизм, экспрессирующий 4-α-глюкантрансферазу, или культуру микроорганизма, экспрессирующего 4-α-глюкантрансферазу.

В способе получения "взаимодействие" можно проводить при рН 5,0-8,0, температуре 60°С-90°С и/или в течение от 1 минуты до 24 часов. В частности, взаимодействие по настоящему изобретению можно проводить при рН 6,0-8,0, рН 6,5-8,0 или рН 6,5-7,5. Кроме того, взаимодействие по настоящему изобретению можно проводить при 60°С-90°С, 70°С-90°С или при 75°С-85°С. Кроме того, взаимодействие по настоящему изобретению можно проводить в течение от 1 минуты до 12 часов, от 1 минуты до 6 часов, от 1 минуты до 3 часов, от 1 минуты до 1 часа, от 5 минут до 24 часов, от 5 минут до 12 часов, от 5 минут до 6 часов, от 5 минут до 3 часов, от 5 минут до 1 часа, от 10 минут до 24 часов, от 10 минут до 12 часов, от 10 минут до 6 часов, от 10 минут до 3 часов или от 10 минут до 1 часа.

Кроме того, взаимодействие по настоящему изобретению можно проводить в присутствии иона или соли металла, выбранного из группы, состоящей из Mg, Mn и Zn. В частности, соль металла по настоящему изобретению может быть солью металла, выбранного из группы, состоящей из MgCl₂, MgSO₄, MnCl₂, MnSO₄, ZnCl₂ и ZnSO₄.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения тагатозы, включающий взаимодействие крахмала, мальтодекстрина, сахарозы или их комбинации и фосфата с (а) тагатозо-6-фосфатфосфатазой; фруктозо-6-фосфат-4-эпимеразой; глюкозо-6-фосфатизомеразой; фосфоглюкомутазой или глюкокиназой; и α-глюканофосфорилазой, крахмалфосфорилазой, мальтодекстринфосфорилазой, сахарозафосфорилазой, α-амилазой, пуллуланазой, изоамилазой, глюкоамилазой или сахаразой; или (б) микроорганизм, экспрессирующий любой из указанных ферментов, или культуру указанного микроорганизма.

Осуществление изобретения

Ниже настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на сопровождающие типичные воплощения. Однако типичные воплощения, раскрытые в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться, как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Пример 1: Получение рекомбинантного экспрессионного вектора, содержащего ген тагатозо-6-фосфатфосфатазы, и трансформированного микроорганизма.

Чтобы обнаружить новую термостабильную D-тагатозо-6-фосфатфосфатазу, был выделен ген из Thermotoga neapolitana, термофильного микроорганизма, и затем были получены рекомбинантный экспрессионный вектор и трансформированный микроорганизм.

В частности, на основании последовательностей генов Thermotoga neapolitana, зарегистрированных в Genbank, был выбран ген t6pp, который, как ожидается, кодирует тагатозо-6-фосфатфосфатазу. Затем, на основании информации о его аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 1) и нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 2), были сконструированы и синтезированы прямой праймер (SEQ ID NO: 3) и обратный праймер (SEQ ID NO: 4). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с синтезированными праймерами, используя хромосомную ДНК (геномную ДНК) Thermotoga neapolitana в качестве матрицы. В частности, при выполнении ПЦР проводили в общей сложности 25 циклов в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 55°С в течение 30 секунд и полимеризация при 68°С в течение 2 минут. Полученные продукты встраивали в рЕТ21а (Novagen Inc.), который представляет собой плазмидный вектор для экспрессии в Е. coli, с использованием ферментов рестрикции NdeI и XhoI, и затем был сконструирован рекомбинантный экспрессионный вектор, названный pET21a-CJ_tn_t6pp. pET21a-CJ_tn_t6pp был трансформирован в штамм Е. coli BL21(DE3) с помощью обычного метода трансформации (Sambrook et al. 1989) с получением микроорганизма, трансформированного с помощью рекомбинантного вектора, включающего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, и полученный микроорганизм был назван как Е. coli BL21(DE3)/CJ_tn_t6pp.

Штамм E.coli BL21 (DE3)/CJ_tn_t6pp был депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ), который является международным депозитарным органом в соответствии с Будапештским договором, 23 июня 2016 года, и получил регистрационный номер КССМ11850Р.

Пример 2: Получение рекомбинантного фермента

Для получения рекомбинантной тагатозафосфатазы (ниже называемой Т6РР), Е. coli BL21 (DE3)/CJ_tn_t6pp инокулировали в пробирку для культивирования, содержащую 5 мл жидкой среды LB и затем инициировали посевную культуру в инкубаторе-встряхивателе при 37°С вплоть до достижения значения поглощения при 600 нм, равного 2,0. Раствор посевной культуры инокулировали в культуральную колбу, содержащую жидкую среду LB и выполняли основное культивирование. При достижении значения поглощения при 600 нм, равного 2,0, добавляли 1 мМ IPTG (изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида) для индукции экспрессии/продуцирования Т6РР. Посевное культивирование и основное культивирование проводили при скорости перемешивания 200 об/мин при температуре 37°С. По завершению основного культивирования культуральный раствор центрифугировали при 4°С при 8000×g в течение 20 минут и затем извлекали клетки. Полученные клетки дважды промывали буфером 50 мМ Tris-HCl (рН 7,0), суспендировали в этом же буфере и затем клетки разрушали с помощью ультразвукового клеточного деструктора. Клеточный дебрис центрифугировали при 4°С при 13000×g в течение 20 минут и затем получали только супернатант. Т6РР очищали из супернатанта с помощью аффинной хроматографии с гистидиновой меткой (His-tag).

Молекулярную массу подтверждали анализом SDS-PAGE, и в результате было обнаружено, что молекулярная масса очищенной Т6РР составляла примерно 29 кДа (обозначен как "Е" на Фиг. 2а).

Пример 3: Определение активности Т6РР в превращении в тагатозу

Для анализа активности Т6РР в превращении тагатозо-6-фосфата в тагатозу, тагатозо-6-фосфат (50 мМ) суспендировали в 50 мМ буфере Tris-HCl (рН 7,5) и к нему добавляли очищенную Т6РР (0,1 ед./мл) и MgCl₂ (10 мМ). После этого полученные продукты подвергали взаимодействию при 70°С в течение 10 минут и затем продукты реакции анализировали с помощью ВЭЖХ. Анализ ВЭЖХ выполняли с использованием колонки НРХ-87Н (Bio-Rad, Inc.) с потоком 5 мМ серной кислоты в подвижной фазе при скорости 0,6 мл/мин при 60°С. Тагатозу и тагатозо-6-фосфат определяли с помощью рефрактометрического детектора.

В результате было обнаружено, что из продукта Т6РР-взаимодействия была получена тагатоза (Фиг. 3).

Пример 4: Определение активности Т6РР в зависимости от рН, температуры и добавления иона металла

4-1. Определение активности в зависимости от рН

Чтобы исследовать влияние рН на Т6РР, очищенную Т6РР (0,1 ед./мл) добавляли к тагатозо-6-фосфату (50 мМ), суспендированному в 50 мМ буфере с различными значениями рН (рН 4,0-7,0, цитрат натрия; рН 4,0-7,0, ацетат натрия; рН 6,0-8,0, фосфат калия: рН 7,0-9,0, Tris-HCl) и затем подвергали взаимодействию при 70°С в течение 10 минут. После этого тагатозу количественно анализировали посредством ВЭЖХ при тех же аналитических условиях, что и в Примере 3.

В результате было подтверждено, что Т6РР показала максимальную активность в буфере Tris-HCl (особенно при рН 7,0) и, что Т6РР показала 80% или более своей активности в очень широком диапазоне рН (5,0-8,0) по сравнению с максимальной активностью (Фиг. 4).

4-2. Определение активности в зависимости от температуры

Чтобы проанализировать активность Т6РР в зависимости от температуры, очищенную Т6РР (0,1 ед/мл) добавляли к тагатозо-6-фосфату (50 мМ), суспендированному в 50 мМ буфере Tris-HCl (рН 7,0) и затем подвергали взаимодействию при 40°С, 50°С, 60°С, 70°С, 80°С и 90°С в течение 10 минут. После этого тагатозу количественно анализировали посредством ВЭЖХ при тех же аналитических условиях, что и в Примере 3.

В результате было показано, что Т6РР проявляет высокую активность при 70°С -90°С, и, в частности, проявляет максимальную активность при 80°С (Фиг. 5).

4-3. Определение активности в зависимости от добавления иона металла

Чтобы исследовать влияние добавления иона металла на активность Т6РР, каждый из ионов металла (например NiSO₄, CuSO₄, MnSO₄, CaCl₂, ZnSO₄, MgCl₂, CoSO₄ и АРО) добавляли к тагатозо-6-фосфату (50 мМ), суспендированному в 50 мМ буфере Tris-HCl (рН 7,0) до конечной концентрации 0,5 мМ. Для удаления ионов металла добавляли Т6РР (0,1 ед./мл), которая была подвергнута диализу путем обработки 10 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), и затем полученные продукты подвергали взаимодействию при 70°С в течение 10 минут. После этого тагатозу количественно анализировали с помощью ВЭЖХ при тех же аналитических условиях, что и в Примере 3.

В результате было подтверждено, что активность Т6РР в большей степени увеличивалась при добавлении иона Mg, и что активность также увеличивалась при добавлении ионов Mn и Zn (Фиг. 6).

Пример 5: Анализ субстратной специфичности Т6РР

Чтобы определить, обладает ли Т6РР субстратной специфичностью к тагатозо-6-фосфату, анализировали активность Т6РР в отношении различных фосфорилированных сахаридов. Каждый из глюкозо-1-фосфата (50 мМ), глюкозо-6-фосфата (50 мМ), фруктозо-6-фосфата (50 мМ), тагатозо-6-фосфата (50 мМ) и тагатозо-6-фосфата (50 мМ) использовали в качестве субстрата. Добавляли 50 мМ буфер Tris-HCl (рН 7,0) и очищенную Т6РР (1 ед./мл), и затем полученные продукты подвергали взаимодействию при 70°С в течение 1 часа. После этого каждый из сахаридов и фосфорилированных сахаридов количественно анализировали с помощью ВЭЖХ в тех же аналитических условиях, что и в Примере 3.

В результате было подтверждено, что Т6РР обладает активностью дефосфорилирования только в отношении тагатозо-6-фосфата (Фиг. 7).

Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные иллюстративные воплощения, специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение, понятно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отступления от технической сущности или существенных характеристик настоящего изобретения. Следовательно, описанные выше воплощения следует считать иллюстративными во всех отношениях и неограничивающими. Кроме того, объем настоящего изобретения определен прилагаемой формулой изобретения, а не подробным описанием изобретения и следует понимать, что все модификации или варианты, выводимые из значений и объема настоящего изобретения, а также их эквиваленты включены в объем прилагаемой формулы изобретения.

Реферат

Настоящее изобретение относится к тагатозо-6-фосфатфосфатазе, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции для получения тагатозы, содержащей тагатозо-6-фосфатфосфатазу по настоящему изобретению, и к способу получения тагатозы с использованием тагатозо-6-фосфатфосфатазы по настоящему изобретению. Изобретение позволяет получить тагатозу с высокой степенью эффективности. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 7 ил., 5 пр.

Формула