Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии комплекса ферментов эндоглюканаз и ксиланаз в клетках гриба penicillium verruculosum и способ получения комплексных ферментных препаратов на его основе, предназначенных для кормопроизводства - RU2653429C1

Чертежи

Описание

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к созданию и производству комплексных ферментных препаратов (ФП), эффективно деградирующих некрахмальные полисахариды зерна. Изобретение может быть использовано в кормовой отрасли в качестве кормовой добавки в корм сельскохозяйственных животных и птиц.

Зерно, являющееся основой любых комбикормов, содержит набор некрахмальных полисахаридов (НПС), которые являются антипитательным фактором и затрудняют процесс переваривания комбикорма. Важнейшими НПС злаков являются β-глюкан и ксилан. Именно вязкие растворы β-глюканов и арабиноксиланов, не гидролизуемых в желудочно-кишечном тракте моногастричных животных, являются основным источником проблем при скармливании ячменя и ржи, и, отчасти, пшеницы (в зависимости от ее вязкости). НПС, в первую очередь ксиланы, сорбируют на себя значительную часть питательных веществ и жидкости, которые в неизменном виде выводятся из организма животных. Это приводит к перерасходу кормов и снижению показателей продуктивности у с/х животных и птицы. Следует учесть, что затраты на корма составляют до 70% от себестоимости конечной продукции животноводства.

Ячмень и рожь содержат значительный процент (до 15%) НПС [Бутейкис Г., Блажинскас Д. Ферменты – гарантия ощутимой выгоды сегодня и в будущем. Комбикорма. №6. 2012. С. 105-106]. Тем не менее, в России, особенно в Центральном и Северо-Западном районе, цена на рожь, овес и ячмень значительно ниже, чем на пшеницу, что определяет экономическую целесообразность использования этих злаков в рационе с/х животных. Влияние антипитательных факторов в виде арабиноксилана и β-глюкана корректируют введением соответствующих ФП, а именно ксиланаз и эндоглюканаз, в рацион животных. Поэтому одной из основных составляющих производства современных комбикормов, обеспечивающих высокие показатели продуктивности животноводства и птицеводства, является использование в рецептурах ФП разного целлюлазно/эндоглюканазного/ксиланазного состава для коррекции антипитательных факторов и улучшения усвояемости компонентов кормов.

Не менее важным фактором, определяющим эффективность применения ферментов (ксиланаз, эндоглюканаз, целлюлаз) для гидролиза природных НПС, является низкая степень или отсутствие ингибирования этих ферментов под действием белков-ингибиторов, входящих в состав большинства злаков. Наличие у зерновых белков-ингибиторов является эволюционным фактором, призванным защитить зерно от поражения микроорганизмами, расщепляющими полисахариды. Водорастворимые зерновые ингибиторы карбогидраз (семейства TAXI, XYP и др.) оказывают значительное действие на эндо-1,4-β-ксиланазы, относящиеся к 11 семье гликозилгидролаз, в то время как ксиланазы, относящиеся к 10 семье, менее подвержены ингибирующему воздействию [Гусаков А.В. // Биохимия. 2010. Т. 75. № 10. С. 1331].

Мицелиальный гриб Penicillium canescens относится к почвенным грибам, основным питательным субстратом которого является ксилано-богатая растительная биомасса, поэтому комплекс секретируемых ферментов гриба представлен, в основном, ксиланазами (КсилА, КсилЕ, КсилF и др.) и арабинофуранозидазами (АБФА, АБФБ и др). Ксиланазы А и Е относятся к 10 семейству гликозилгидролаз, при этом КсилЕ практически не ингибируется белками ржи. Разница в уменьшении приведенной вязкости для нативного и термоинактивированного экстрактов составляет лишь 5%. В случае КсилА эта разница выражена намного более заметно (~30%) [Денисенко Ю.А. с соавт // Сравнительная характеристика ксиланаз XylA и XylE из гриба Penicillium canescens. Вестник московского университета. Серия 2. Химия. 2015, т. 56, №6, с. 348-353].

Мицелиальный гриб Penicillium verruculosum PV2007 (ВКМ F-3972D) обладает собственным гидролитическим комплексом ферментов для биодеградации целлюлозосодержащих растительных материалов. В этот комплекс входят целлобиогидролазы различной специфичности, набор эндоглюканаз и β-глюкозидаза. Для реципиентного штамма P. verruculosum 537 (ΔniaD) разработана трансформационная и экспрессионная системы [патент RU 2378372 С2, опубл. 10.01.2010, бюл. №1], что позволяет использовать данный гриб как основу для получения рекомбинантных штаммов различного промышленного применения [Мерзлов Д.А. с соавт // Свойства ферментных препаратов и гомогенных ферментов эндоглюканазы EG2 Penicillium verruculosum и эндоглюканазы LAM Myceliophtora thermophile. Биохимия, 2015, том 20, вып.4, с.556-567; Синицын А.П. с соавт // Оптимизация состава целлюлазного ферментного комплекса Penicillium verruculosum: увеличение гидролитической способности с помощью методов генетической инженерии. Кат в пром. 2015, Т. 15, №6, с.78-83; заявка на патент №2015151483 от 02.12.2015; патент RU 2550044 C2, опубл. 10.05.2015, бюл. №13; патент RU 2532840 C2, опубл. 19.11.2014, бюл. №31].

Таким образом, разработка новых высокоэффективных и стабильных ФП для кормопроизводства, которые не будут подвержены ингибирующему действию растительных белков-ингибиторов карбогидраз, а также будут эффективны при кормлении сельскохозяйственных животных и птицы, является важной и актуальной задачей современного агропромышленного комплекса.

Техническая задача, на решение которой направлено данное изобретение, состоит в получении комплексных ФП на основе новых рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum, являющихся продуцентами гомологичной высокоэффективной эндоглюканазы II, принадлежащей 5 семейству гликозил-гидролаз, и гетерологичной неингибируемой ксиланазы Е из Penicillium canescens, относящейся к 10 семейству гликозил-гидролаз для применения в кормопроизводстве при обработке рационов, содержащих зерновые, в частности рожь и ячмень.

Технический результат от предлагаемого изобретения состоит в снижении вязкости корма, содержащего НПС ячменя или ржи, и повышении кормовой ценности рационов для сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы при обработке корма новыми комплексными ФП, содержащими высокоактивную эндоглюканазу, неингибируемую ксиланазу и комплекс сопутствующих карбогидраз.

Сущность изобретения заключается в получении новых штаммов-продуцентов:

- Penicillium verruculosum EX13 (ВКМ F-4765D), который при выращивании на ферментационных средах на основе микрокристаллической целлюлозы и гидролизата куриного белка обеспечивает получение ФП комплексного действия, включающего неингибируемую эндо-1,4-β-ксиланазу (ксиланазу Е), высокоактивную эндо-1,4-β-глюканазу (эндоглюканазу II) с активностями в КЖ 550 ед./мл (по ксилану, рН 5,0, 50°С) и 500 ед./мл (Na-КМЦ, рН 5,0, 50°С) соответственно, и комплекс сопутствующих карбогидраз: целлобиогидролаза I, целлобиогидролаза II, β-глюкозидаза;

- Penicillium verruculosum EX35 (ВКМ F-4766D), который при выращивании на ферментационных средах на основе микрокристаллической целлюлозы и гидролизата куриного белка обеспечивает получение ФП комплексного действия, включающего неингибируемую эндо-1,4-β-ксиланазу (ксиланазу Е), высокоактивную эндо-1,4-β-глюканазу (эндоглюканазу II) с активностями в КЖ 800 ед./мл (по ксилану, рН 5,0, 50°С) и 300 ед./мл (Na-КМЦ, рН 5,0, 50°С) соответственно, и комплекс сопутствующих карбогидраз: целлобиогидролаза I, целлобиогидролаза II, β-глюкозидаза.

Способ получения ФП предусматривает глубинное культивирование штаммов–продуцентов P. verruculosum EX13 (BKM F-4765D) и P. verruculosum EX35 (ВКМ F-4766D) на удешевленной среде с заменой дрожжевого экстракта на гидролизат куриного белка с последующей распылительной сушкой культуральной жидкости. Изобретение позволяет получать ФП с высокой активностью целевых эндоглюканазы II и неингибируемой ксиланазы Е. Полученный ФП характеризуется высокой стабильностью, эффективностью при обработке кормовых смесей, содержащих ячмень и/или рожь, по сравнению с коммерческими ФП. Применение нового комплексного ФП позволит повысить кормовую ценность рационов на основе зерновых культур.

Изобретение реализуется следующим образом.

Штаммы P. verruculosum EX13 (BKM F-4765D) и P. verruculosum EX35 (ВКМ F-4766D) получены из исходного штамма Penicillium verruculosum PV2007 (ВКМ F-3972D) путем трансформации плазмидой pEGII-XylE с последующей селекцией на агаризованной среде с 10 мМ NaNO₃.

Культурально-морфологические и микроскопические особенности штаммов (общие для P. verruculosum EX13 и P. verruculosum EX35):

Растут на агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым автолизатом, Мальц-агар, глюкозокартофельный агар, сусло-агар) при t 26-30°С в течение 7-10 суток, рН 4.5-5.0.

На среде Чапека с дрожжевым экстрактом при культивировании гриба при 25°С на 7 сутки колонии достигают 24-30 мм в диаметре, складчатые, поверхность сильно радиально плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, имеет ширину 1.5-2.0 мм. Мицелий светло-желтоватый, шерстистый, центр колонии выпуклый, конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Экссудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая, в центре колонии – палево-оранжевая. При температуре 37°С колонии диаметром 5 мм, мицелий светлый, конидиообразования нет. При температуре 5°С роста нет.

При росте на Мальц-агаре диаметр колонии 23-24 мм, поверхность сильно радиально складчатая, плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, шириной 1,5-2,0 мм. Мицелий белый, шерстистый, прижатый, конидиогенез очень слабый, практически отсутствует. Эксудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая.

При микроскопировании штаммы имеют конидиеносцы двухъярусные, терминальные, бивертициллятные, гладкие длиной около 150 мкм, шириной 2-3 мкм. Метулы расходящиеся размером 10-13х2.5-3.0 мкм, фиалиды ампуллиформные размером 7-8х2.8-3.0 мкм. Конидии округлые, шероховатые размером 3.0-3.5 мкм.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) штаммы образуют рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная культивирования 0,1 ч^-1.

Физиолого-биохимические признаки штамма:

Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования целлюлаз 28°С (26-29°С). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом не наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз.

Резистентность к нистатину хорошая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.

Является прототрофом. Способен быстро ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, D-маннозу, D-маннит, трегалозу, сорбозу и сорбит, медленнее - D-ксилозу, L- и D-арабинозу, L-рамнозу и рибозу. Слабо ассимилирует: D-глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу и 5-тио-D-глюкозу.

Использует неорганический и органический азот, хорошо ассимилирует нитратную и аммонийную форму азота.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, ламинарине, β-глюкане.

Штамм P. verruculosum EX13 (BKM F-4765D) отличается от исходного повышенной продукцией неингибируемой ксиланазы Е и высокоактивной эндоглюканазы II.

Штамм P. verruculosum EX35 (BKM F-4766D) отличается от исходного преимущественной продукцией неингибируемой ксиланазы Е и повышенной продукцией высокоактивной эндоглюканазы II.

В предлагаемом изобретении метод определения ксиланазной, β-глюканазной и КМЦ-азной активностей основан на измерении скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС) методом Шомоди-Нельсона при гидролизе полисахаридных субстратов (ксилана из древесины березы, βглюкана ячменя и карбоксиметилцеллюлозы, натриевой соли соответственно). За единицу активности принимается такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль ВС в минуту при рН 5.0 и 50°C [Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.А. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. – М.: МГУ, 1995. – 144 с.].

Новые комплексные ФП обладают улучшенными эксплуатационными характеристиками, включая устойчивость к ингибированию со стороны зерновых белковых ингибиторов и увеличенную операционную стабильность, что является преимуществом данных ферментных препаратов в сравнении с имеющимися на рынке коммерческими аналогами.

Применение новых комплексных ФП высокоактивной эндоглюканазы II и неингибируемой ксиланазы Е существенно повысит рентабельность применения комплексных препаратов в кормопроизводстве за счет обеспечения оптимального сочетания основных ферментативных активностей, необходимых для гидролиза НПС зерновой составляющей рациона корма с/х животных и птиц.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды pEGII-XylE состояло из амплификации генов eglII P. verruculosum [патент РФ № 2378372], xylE P. canescens [AN: FJ860894], промоторной и терминаторной области гена cbhI P.verruculosum [патент РФ № 2378372], и финальной амплификации линейного продукта, состоящего из состыкованных генов, соответствующих промоторной области гена cbhI, гена eglII и гена xylE, соединенных через синтетический линкер, и терминаторной области гена cbhI P. verruculosum.

Для индивидуальной амплификации каждой из частей плазмиды использовались следующие олигонуклеотиды:

Далее с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и праймеров (1 и 3) синтезируют отдельно промоторную область гена cbhI размером 1303 п.н. В качестве матрицы для ПЦР используют геномную ДНК штамма P. verruculosum, выделенную из мицелия. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяют методом Сэнгера по обеим цепям.

Далее с помощью ПЦР и праймеров (2 и 5) синтезируют отдельно ген eglI I размером 1367 п.н., из которых 1343 п.н. составляет ген eglII, 24 п.н. относятся к синтетическому линкерному участку, соединяющему ген eglII c 3`-конца гена и ген xylE с 5`-конца гена. В качестве матрицы для ПЦР используют геномную ДНК штамма P. verruculosum, выделенную из мицелия. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяют методом Сэнгера по обеим цепям.

Далее с помощью ПЦР и праймеров (4 и 7) синтезируют отдельно ген xylE размером 1148 п.н. В качестве матрицы для ПЦР используют геномную ДНК штамма P. canescens, выделенную из мицелия. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента также определяют методом Сэнгера по обеим цепям.

Далее с помощью ПЦР и праймеров (6 и 8) синтезируют ген cbhI и его терминаторную область размером 570 п.н. В качестве матрицы для ПЦР используют геномную ДНК штамма P. verruculosum, выделенную из мицелия. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяют методом Сэнгера по обеим цепям.

Полученные ПЦР-фрагменты смешивают в эквимолярном соотношении и используют в качестве матрицы для финальной ПЦР-реакции при помощи праймеров (1) и (8). Синтезированный линейный фьюжн-фрагмент имеет размер 4388 п.н. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяют методом секвенирования по Сэнгеру по обеим цепям. Далее, полученный фрагмент клонируют в лабораторный вектор pUC-LIC с образованием плазмиды pEGII-XylE. Структура плазмиды pEGII-XylE представлена на фиг.1. На фиг. 1 темно-серым обозначены промоторная и терминаторная области гена cbhI, светло-серым гены eglII и xylE, между генами eglII и xylE обозначен линкер.

Плазмида pEGII-XylE была трансформирована в реципиентный штамм P.verruculosum 537 (ΔniaD) совместно с трансформирующей плазмидой pSTA10 по стандартной методике [Sambrook, J., and Russell, D.W. (2001) Molecular cloning:a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., A.Y. Aleksenko, N.A. Makarova, I.V. Nikolaev, A.J. Clutterbuck, Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet. 28 (1995) 474-478]. В результате трансформации было получено более 200 рекомбинантных штаммов серии P. verruculosum EX, из которых в результате первичного скрининга на стандартной среде культивирования были отобраны 10 клонов (Таблица 1). Стандартная среда культивирования имела следующий состав (г/л): KH₂PO₄ - 15, (NH₄)₂SO₄ - 5, MgSO₄×7H₂O - 0,3, CaCl₂×2H₂O - 0,3, дрожжевой экстракт - 10, целлюлоза – 20, пшеничные отруби - 10.

Анализ удельных активностей в культуральной жидкости 10 рекомбинантных штаммов (Таблица 1) показал наличие клонов с различными комбинациями ксиланазной и КМЦ-азной активностей, что позволило отобрать два штамма для дальнейших прикладных испытаний - Penicillium verruculosum EX13 с приблизительно равными целевыми ферментативными активностями ксиланазы и эндоглюканазы и Penicillium verruculosum EX35 с превалирующей ксиланазной активностью.

Пример 2. Культивирование штаммов Penicillium verruculosum EX13 (ВКМ F-4765D) и Penicillium verruculosum EX35 (ВКМ F-4766D) проводили в ферментерах объемом 3 л, оснащенных барботерами для подачи воздуха в аппарат и турбинной мешалкой на средах 1 и 2 следующего состава:

Среда 1. Стандартная среда (г/л):

Среда 2. Экспериментальная среда (г/л):

В экспериментальной среде вместо французского дрожжевого экстракта («Lessafre», Франция) использовался отечественный гидролизат куриного белка (ООО «Симбио», Россия) в том же процентном соотношении, что и дрожжевой экстракт в стандартной среде.

Культивирование проводили 144 ч, при рН не ниже 4,5 и 32°С. Образцы культуральной жидкости отбирали каждые сутки, начиная с 72 ч культивирования, центрифугировали и измеряли активности (Таблица 2).

Анализируя динамику накопления белка и биосинтез ксиланазы Е и эндоглюканазы II в культуральных жидкостях рекомбинантных штаммов P. verruculosum EX13 и P. verruculosum EX35 в процессе проведения ферментации, следует заключить, что замена дорогостоящего импортного дрожжевого экстракта на дешевый отечественный гидролизат куриного белка не влияет на биосинтез целевых ферментов в процессе культивирования рекомбинантных штаммов. Это означает что замена данного компонента целесообразна.

Культуральные жидкости рекомбинантных штаммов P. verruculosum EX13 и P. verruculosum EX35, полученные на Среде 2, были сепарированы с отделением биомассы гриба и высушены на распылительной сушке. Таким образом, были получены комплексные ферментные препараты (ФП) EX13 и EX35 c удельными ферментативными активностями по ксилану березы - 22500 и 30000 ед./г ФП, и по КМЦ - 19500 и 9000 ед./г ФП соответственно.

Сухие ферментные препараты были упакованы в двойные пластиковые мешки и хранились при температуре +6+3°С.

Пример 3. Водный экстракт из зерен ржи готовили следующим образом.

Зерно ржи очищали от посторонних включений и размалывали на лабораторной мельнице. На сите отбирали фракцию менее 0,5 мм.

Взвешивали 20,0 г размолотых зерен, прибавляли 100 мл натрий-ацетатного буфера (0,1 М, рН 5,0) и проводили экстракцию с использованием микробиологической качалки при температуре 40+1°С и 250 об/мин в течение 3 часов. Центрифугированием отделяли осадок от экстракта, после чего экстракт фильтровали через ткань типа ФП с размером пор около 10 мкм. Полученный нативный экстракт, содержащий водорастворимые белковые ингибиторы, укупоривали и хранили во льду в течение рабочего дня.

Экстракт, свободный от белковых ингибиторов, готовили путем нагревания части нативного экстракта в емкости на водяной бане при температуре 100°С в течение 10 минут с последующей фильтрацией через ткань типа ФП для отделения термоденатурированных белковых ингибиторов. Получали термоинактивированный экстракт, свободный от белковых ингибиторов, который укупоривали и хранили во льду в течение рабочего дня.

Капиллярный вискозиметр Оствальда подготавливали согласно инструкции по эксплуатации. Помещали вискозиметр в водяную баню при температуре 40+0,1°С, перед началом измерений все образцы инкубировали в течение 6-7 минут. Проводили определение времени истечения натрий-ацетатного буфера (0,1 М, рН 5,0), нативного и термоинактивированных экстрактов. Все измерения проводили с точностью до 0,1 с в трех повторностях.

К нативному и термоинактивированому экстракту прибавляли раствор ферментного препарата, содержащий 1 единицу ксиланазной активности, объемом, равным 1% от объема экстракта, и определяли динамику измерения времени истечения через равные промежутки времени на протяжении 25 минут. Время начала реакции отсчитывали от момента добавления к экстракту раствора ФП. Результаты представляли в виде зависимости отношения приведенной вязкости экстракта после добавления раствора ФП к приведенной вязкости исходного экстракта от времени ферментативной обработки.

Вязкость растворов η_i в каждой точке рассчитывали по формуле η_i = К⋅ρ⋅t К – константа вискозиметра, ρ – плотность раствора, t – время истечения раствора. η₀, η_буф – начальная вязкости экстракта и буфера, определенные вискозиметрическим методом. Относительную вязкость экстракта рассчитывали как η_отн = η/η_буф; удельную вязкость рассчитывали, как η_уд = (η – η_буф)/η_буф = η_отн-1, приведенную вязкость рассчитывали как η_прив=η_уд/С, где С – весовая концентрация полимера. η_iуд/η_0уд=η_iприв/η_0прив, где η_0уд и η_0прив – удельная и приведенная вязкости экстракта до добавления раствора ферментного препарата; η_iуд и η_iприв после добавления раствора ферментного препарата в момент времени ферментативной обработки в точке i. Время ферментативной обработки i = время начала измерения времени истечения + ½⋅время истечения в точке i (за исключением начальной точки). Снижение удельной вязкости Δη_iуд относительно вязкости экстракта в начальной точке рассчитывали, как (1-η_iуд/η_0уд)⋅100% = (1-η_iприв/η_0прив)⋅100%.

Среднее время эффективной работы внесенных с кормом ферментов в организме курицы составляет около 20-30 минут, после чего происходит их расщепление в желудочно-кишечном тракте. Результаты уменьшения вязкости нативного (светлые столбики на Фиг.2) и термоинактивированного (темные столбики на Фиг 2) экстракта после 25 минут ферментативной обработки представлены на Фиг. 2. В качестве контроля использовался ряд коммерческих ферментных препаратов, широко используемых в качестве кормовых добавок в составе современных рационов кормления с/х животных и птицы. К ним относятся: #2341 – Ronozyme WX (CT), #2343 – Natugrain TS, #2346 – Rovabio XL. Все препараты были дозированы по 1 Ед активности ксиланазы в реакционной смеси. Как видно из Фиг.2 максимальное значение снижения вязкости как термоинактивированного, так и нативного экстракта ржи наблюдалось в случае использования новых ферментных препаратов EX13 и EX35, что говорит о потенциальной эффективной применимости этих препаратов в рационах кормления с/х животных и птицы.

Таблица 1. Удельные активности ферментов (ед./мг) и концентрация белка (мг/мл) в культуральных жидкостях полученных рекомбинантных штаммов по сравнению с контрольным образцом (нетрансформированный штамм, Контроль)

Таблица 2. Динамика накопления белка (мг/мл) и биосинтез ксиланазы Е и эндоглюканазы II в культуральных жидкостях рекомбинантных штаммов P. verruculosum EX13 и P. verruculosum EX35 в процессе проведения ферментации в 1-л ферментерах на Средах 1 и 2.

*- Первая цифра соответствует параметрам биосинтеза ферментов в штамме P. verruculosum EX13, вторая цифра соответствует параметрам биосинтеза ферментов в штамме P. verruculosum EX35.

Реферат

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к генетической конструкции для обеспечения экспрессии целевых гомологичного и гетерологичного генов в клетках реципиентного гриба Penicillium verruculosum. Настоящая конструкция содержит целевую кодирующую последовательность, включающую последовательно соединенные ген eglII, кодирующий высокоактивную эндо-1,4-β-глюканазу II, и ген xyIE Penicillium canescens, кодирующий неингибируемую эндо-1,4-β-ксиланазу Е. Изобретение также относится к рекомбинантным штаммам Penicillium verruculosum ЕХ13, ВКМ F-4765D, и Penicillium verruculosum EX35, ВКМ F-4766D. Указанные штаммы предназначены для продукции гомологичной высокоактивной эндо-1,4-β-глюканазы II и неингибируемой эндо-1,4-β-ксиланазы Е Penicillium canescens. Настоящее изобретение позволяет получать неингибируемую эндо-1,4-β-ксиланазу Е Penicillium canescens и высокоактивную эндо-1,4-β-глюканазу II Penicillium verruculosum. 4 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 3 пр.

Формула