Штамм мицелиального гриба penicillium verruculosum - продуцент комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы и способ получения ферментного препарата комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы - RU2361918C1

Описание

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности, в сельском хозяйстве, для переработки растительного сырья.

Ферментные комплексы, содержащие целлюлозо- и гемицеллюлозолитические ферменты, гидролизующие основные компоненты клеточной стенки (как и отдельные составляющие их ферменты), могут применяться для биодеградации целлюлозо- и гемицеллюлозосодержащих субстратов, в том числе отходов промышленности и сельского хозяйства, для конверсии растительной биомассы и получения сахаров, биоэтанола и других продуктов микробного синтеза, для деструкции клеточных стенок растений, для гидролиза некрахмальных полисахаридов, а также в пищевой и спиртовой промышленности, в пивоварении, в качестве добавок в кормах, для силосования кормов в сельском хозяйстве.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является мутантный штамм Penicillium funiculosum S2006 ВКМ F-3887D, продуцирующий комплекс карбогидраз (целлюлаз, β-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ), полученный с помощью многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры P.funiculosum ВКМ F-3661D с применением ультрафиолетового облучения (заявка на патент РФ №2006110721/13 (011668), C12N 9/00, С12Р 19/00 от 4 апреля 2006 г.).

Техническая задача, на решение которой направлено разработанное изобретение, - расширение арсенала высокопродуктивных штаммов-продуцентов ферментов целлюлазного и гемицеллюлазного комплексов, обладающих высокой специфической активностью и предназначенных для высокоэффективной деструкции природного растительного сырья, отходов его промышленной и сельскохозяйственной переработки, для гидролиза растительных полисахаридов.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, состоит в получении нового высокопродуктивного штамма мицелиального гриба рода Penicillium, осуществляющего биосинтез комплекса целлюлаз, обладающих высокой специфической активностью (целлобиогидролаз, эндоглюканаз, целлобиаз и β-глюкозидаз), целлобиаз (β-глюкозидаз) и сопутствующих ферментов (ксиланаз и ксилоглюканаз).

Сущность объекта изобретения - новый специально селекционированный штамм мицелиального гриба P.verruculosum PV2007 - продуцент комплекса целлюлаз, обладающих уникально высокой специфической активностью (целлобиогидролаз, эндоглюканаз, целлобиаз и β-глюкозидаз), целлобиаз (β-глюкозидаз) и сопутствующих ферментов (ксиланаз и ксилоглюканаз).

Штамм мицелиального гриба P.verruculosum PV2007 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под номером ВКМ F-3972D.

Штамм P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D получают с помощью многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры P.verruculosum 28К ВКМ F-3764D. Суспензию спор исходного штамма облучают ультрафиолетом. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, основу которых составляет среда Гетчинсона с добавлением 0,5% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), культивируют при 28°С в течениие 2 суток и проводят окрашивание Конго Красным. Мутанты с улучшенной продукцией отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза целлюлаз, целлобиаз (β-глюкозидаз), ксиланаз и ксилоглюканаз при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах наиболее активные варианты снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше. Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на косячках с агаризованной средой Чапека или сусло-агаре при +4°С с обязательным пересевом не реже одного раза в течение 3-6 месяцев.

Кулътурально-морфологические признаки штамма. При росте на Мальц-агаре диаметр колоний достигает 36 мм на 7 сутки при росте при 25°С. Колонии плотные, ровные с выпуклым центром. Мицелий светлый, пушистый. Обратная сторона палево-красновато-оранжевая. Конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом на 7-ые сутки имеют 27-30 мм в диаметре, складчатые, с ровным краем, поверхность шерстистая. Мицелий светлый, желтоватый. Обратная сторона - палево-оранжевая. Конидиогенез слабый.

Гриб не растет на среде с глицерином и на агаре Чапека при 5°С. При культивировании на агаре Чапека при 37°С колонии имеют 18 мм в диаметре, складчатые, средней плотности, обратная сторона буровато-красноватая.

Конидиогенез: кисточки бивертициллятные, метулы прижатые, гладкие (8-10×2,5-3,0). Фиалиды ацерозные (8-9×2,5-3,0), с короткой шейкой. Конидии эллиптические, мелкие (2,2×1,5-2,0), гладкие.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляла 0,35 ч^-1, в конце культивирования - 0,1 ч^-1.

Физиолого-биохимические признаки штамма. Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования целлюлаз 28°С (26-29°С). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз. Резистентность к нистатину хорошая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.

Является прототрофом. Способен быстро ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, маннозу, маннит, трегалозу, сорбозу и сорбит, медленнее - арабинозу, рамнозу и рибозу. Слабо ассимилирует: глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, дезоксиглюкозу и тиоглюкозу.

Использует неорганический и органический азот, хорошо ассимилирует нитратную и аммонийную форму азота.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, ламинарине, β-глюкане, лихенине, пектине, и галактоманнане. Способен утилизировать молочную кислоту при концентрации ниже ингибирующей.

Катаболитная репрессия биосинтеза карбогидраз значительно снижена. Проверка катаболитной репрессии биосинтеза карбогидраз заключается в следующем. Конидии пересевают в пробирки с минимальной средой, содержащей минеральные соли, следовое количество (0,5 г/л) дрожжевого экстракта, аморфную целлюлозу, а также исследуемый репрессор или антиметаболит (глюкоза, дезоксиглюкоза, лактоза, глицерин и др.). Диаметр пробирки - 9 мм, высота столбика агара 50-60 мм. Пробирку инкубируют 4 суток при 30°С и затем 20 ч при 45°С. Об устойчивости биосинтеза карбогидраз к катаболитной репрессии судят по глубине зоны деструкции аморфной целлюлозы (по размеру зоны просветления столбика агара в пробирке) в присутствии репрессора или антиметаболита).

Полученный мутантный штамм P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D по своим морфологическим признакам при росте на глюкозокартофельном агаре, на агаре для споруляции (СМ-агаре) отличается от исходного штамма P.verruculosum 28K ВКМ F-3764D существенно сниженной интенсивностью спороношения, изменением цвета конидий (с серо-зеленого на темно-серый) и окраской колонии с обратной стороны при выращивании на твердых средах, более медленным ростом на агаризованных средах и повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу целлюлаз, целлобиаз (β-глюкозидаз), ксиланаз и ксилоглюканаз.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения».

Культивирование штамма P.verruculosum PV2007 ВKМ F-3972D проводят в аэробных условиях в погруженном состоянии на водной питательной среде, содержащей один или несколько субстратов - источников углерода, являющихся индукторами биосинтеза ферментов. В качестве субстратов могут использоваться и субстраты, не являющиеся непосредственно индукторами. Штамм способен в соответствующих условиях проведения процесса культивирования на основе использования нерастворимых, например, микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) и растворимых, например глюкоза, субстратов секретировать в культуральную среду комплекс ферментов - целлюлаз (целлобиогидролаз, эндоглюканаз), целлобиаз (β-глюкозидаз), ксиланаз и ксилоглюканаз. Глюкоза в среде культивирования может быть заменена более дешевым продуктом - гидролизатом крахмала.

Ферментные препараты, полученные с использованием полученного штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде концентрированных препаратов, получаемых с использованием ультрафильтрации, в виде сухих препаратов или гранулированных препаратов.

Возможность использования изобретения иллюстрировано примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Культивирование штамма P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D в качалочных колбах.

Для получения посевного материала (инокулята) культуру гриба P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D выращивают на сусло - или СМ-агаре при 29°С в течение 7 суток и далее - при комнатной температуре на свету в течение 7 суток. Засев колб проводят 1 мл суспензии спор, смытых с агара водой, содержащей 0,1% твина 80. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл водной ферментационной среды предпочтительно следующего состава, в г/л: МКЦ - 50, пшеничные отруби - 12 дрожжевой экстракт - 12, (NH₄)₂SО₄ - 5, KН₂РО₄ - 5, MgSO₄×7H₂О - 0,3, СаСl₂×2Н₂О - 0,3, рН 4,5. Колбы инкубируют на качалке при 32°С и 200 об/мин. в течение 120-144 ч. Целлобиогидролазная активность после окончания ферментации в колбах составляет 19-20 ед/мл, эндоглюканазная активность - 320-350 ед/мл, β-глюкозидазная активность - 20-25 ед/мл, целлобиазная активность - 10-12 ед/мл, ксиланазная активность - 530-540 ед/мл, ксилоглюканазная активность - 200-220 ед/мл.

Пример 2. Культивирование штамма P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D в ферментере.

Проводят культивирование штамма P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D в 10-литровом ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 6,0 л., используя предпочтительно питательную среду того же состава, что в качалочных колбах при рН 4,5 и 32°С в течение 120-144 час. Через 36 часов после начала ферментации (и до конца ферментации) осуществляют подпитку глюкозой путем непрерывной подачи ее водного раствора в ферментер со скоростью 1 г/л/час. Целлобиогидролазная активность после окончания ферментации составляет 60-65 ед/мл, эндоглюканазная активность - 820-850 ед/мл, β-глюкозидазная активность - 60-70 ед/мл, целлобиазная активность - 25-30 ед/мл, ксиланазная активность - 1550-1600 ед/мл, ксилоглюканазная активность - 610-640 ед/мл.

После окончания ферментации культуральную жидкость, содержащую комплекс целлюлаз и сопутствующих ферментов, подвергают ее ультрафильтрации на полых волокнах (с пределом отсечения 10 кДa) и лиофильно высушивают ультраконцентрат с получением сухого ферментного препарата. Целлобиогидролазная активность сухого ферментного препарата составляет 900-920 ед/г, эндоглюканазная активность - 14500-14900 ед/г, β-глюкозидазная активность - 1200-1250 ед/г, целлобиазная активность - 600-670 ед/г, ксиланазная активность - 23000-24000 ед/г, ксилоглюканазная активность - 7500-8200 ед/г.

Пример 3. Сравнительный анализ активности ферментного комплекса P.verruculosum.

Анализ активности проводят сравнивая полученный, как указано выше, ферментативный препарат с аналогичными препаратами целлюлаз и сопутствующих ферментов, полученных с помощью штаммов-продуцентов мицелиальных грибов родов Penicillium и Trichoderma. При этом используют ферментативные препараты и методики, приведенные ниже.

Используют следующие коммерческие (промышленные) и лабораторные ферментные препараты: ферментные препараты на основе грибов рода Penicillium - препарат PV2007 (получен с помощью штамма P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D, как указано в примере 2), препарат S-2006 (получен с помощью штамма P.funiculosum S2006 ВКМ F-3887D как указано в заявке на патент РФ №2006110721/13 (011668), C12N 9/00, С12Р 19/00 от 4 апреля 2006 г.), ферментные препараты на основе грибов рода Trichoderma: препарат Целловиридин Г20Х (T.longibrachiatum), компании ООО «Промфермент» (Россия), препарат BioACE компании Dyadic International Ltd., США (T.longibrachiatum), препараты Spezyme CP и Accellerase 1000 компании Genencor/Danisco, препарат Celluclast 1.5L (T.reesei) компании Novozymes, Дания, препарат Fibrilase HDL 160 (Т.reesei), компании Iogen, Канада. Удельные активности ферментных препаратов (в ед/мг белка) приведены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 очевидно, что наибольшую активность проявляет ферментный препарат PV2007, полученный с помощью заявляемого штамма P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D.

Методы определения активности. Целлобиогидролазную (авицелазную) активность измеряют проводя гидролиз МКЦ (5 мг/мл) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 50°С в течение 60 минут. После этого определяют в реакционной смеси концентрацию восстанавливающих сахаров (ВС) методом Нельсона-Сомоджи. За единицу целлобиогидролазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минут при температуре 50°С и рН 5,0 при гидролизе суспензии МКЦ концентрацией 5 мг/мл освобождает количество ВС, эквивалентных 1 микромолю глюкозы, и определяемых методом Сомоджи-Нельсона.

Эндоглюканазную (КМЦ-азную) активность измеряют, проводя гидролиз водорастворимой Na-соли карбоксиметилцеллюлозы (5 мг/мл) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 50°С в течение 10 минут. За единицу эндоглюканазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при температуре 50°С и рН 5,0 при гидролизе раствора КМЦ концентрацией 5 мг/мл приводит к образованию количества ВС, эквивалентного 1 микромолю глюкозы, определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов, Учебное пособие, М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).

β-Глюкозидазную активность измеряют, проводя гидролиз 0,5 мг/мл п-нитрофенил-β-D-глюкозида (пНФГ) при рН 5,0 (0,05 М ацетатный буфер) и 40°С в течение 10 минут. Реакцию останавливают 1 М Nа₂СО₃, после чего измеряют оптическую плотность при 400 нм. За единицу β-глюкозидазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при рН 5,0 и 40°С приводит к образованию 1 микромоля п-нитрофенола.

Целлобиазную активность измеряют проводя гидролиз целлобиозы (2,5 мМ) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 40°С в течение 10 минут. За единицу целлобиазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при температуре 40°С и рН 5,0 при гидролизе раствора целлобиозы концентрацией 2,5 мМ приводит к образованию 1 микромоль глюкозы (глюкозу определяют глюкозооксидазно-пероксидазным методом. Итоги науки и техники, серия Биотехнология, т.25, ВИНИТИ, Москва, 1993, с.34).

Ксиланазную активность измеряют проводя гидролиз березового ксилана (5 мг/мл) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 50°С в течение 10 минут. За единицу ксиланазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при температуре 50°С и рН 5,0 при гидролизе раствора ксилана концентрацией 5 мг/мл приводит к образованию количества ВС, эквивалентных 1 микромолю ксилозы, определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов, Учебное пособие, М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).

Ксилоглюканазную активность измеряют проводя гидролиз ксилоглюкана тамариска (5 мг/мл) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 50°С в течение 10 минут. За единицу ксилоглюканазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при температуре 50°С и рН 5,0 при гидролизе раствора ксилоглюкана концентрацией 5 мг/мл приводит к образованию количества ВС, эквивалентных 1 микромолю глюкозы, определяемых методом Сомоджи-Нельсона.

Таким образом, предлагаемый штамм P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D обладает способностью продуцировать комплекс высокоактивных целлюлаз, включающий целлобиогидролазы, эндоглюканазы, целлобиазы (β-глюкозидазы) и сопутствующих ферментов (ксиланаз и ксилоглюканаз), что создает возможность получения активного и полного комплекса ферментов, а также, при необходимости - отдельных индивидуальных ферментов, гидролизующих основные компоненты клеточной стенки растений, осуществляющих биодеградацию целлюлозо- и гемицеллюлозосодержащих субстратов, в том числе отходов промышленности и сельского хозяйства, а также осуществляющих конверсию растительной биомассы и получение сахаров, биоэтанола и других продуктов микробного синтеза, для получения ферментов для применения в пищевой и спиртовой промышленности, в пивоварении, в качестве добавок в кормах, для силосования кормов в сельском хозяйстве.

Для достижения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов.

Технический результат, получаемый при реализации предложенного технического решения, состоит в существенном увеличении эффективности действия ферментных препаратов и расширении спектра использования ферментных препаратов в различных областях биотехнологии.

Реферат

Ферментный препарат комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы получают культивированием штамма Penicillium verruculosum BKM F-3972D на водной среде, содержащей в г/л: целлюлозу - 50-60, глюкозу - 10-30, минеральные соли - KН2РО4 8-12, (NH2)2SO4 3-7, MgSO4·7H2O 0,2-0,4, CaCl2·2H2O 0,2-0,4, при непрерывной подпитке глюкозой. Процесс культивирования ведут при температуре 26-30°С и поддержании рН в диапазоне 4,5-5,0. Культуральную жидкость, содержащую ферментный препарат, отделяют через 120-144 ч после начала культивирования, подвергают ультрафильтрации и высушивают. Это обеспечивает высокую специфическую активность комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы и способствует повышению эффективности использования ферментного препарата в различных областях биотехнологии. 2 н.п. ф-лы., 1 табл.

Формула