Цифровая микробиология - RU2018130726A
Код документа: RU2018130726A
Формула
1. Способ определения наличия или отсутствия микроорганизма в образце, включающий:
i) инкапсуляцию образца во множестве капель эмульсии типа «вода-в-масле», при этом капли эмульсии типа «вода-в-масле» дополнительно инкапсулируют микробиологическую питательную среду;
ii) инкубацию множества капель эмульсии типа «вода-в-масле» при температуре, допускающей микробиологический рост, и в течение периода времени, достаточного для того, чтобы микроорганизмы-мишени могли пройти через 5-45 периодов времени удвоения;
iii) определение капель эмульсии типа «вода-в-масле», содержащих микроорганизмы-мишени; и
iv) в ответ на идентификацию микроорганизма-мишени по меньшей мере в одной капле эмульсии типа «вода-в-масле», определение того, что микроорганизм-мишень присутствует в образце, где микроорганизмы-мишени выбирают из дрожжей и плесени, и в котором этап инкубации выполняют в течение периода времени, соответствующего:
по меньшей мере около 6 часов и не более чем около 12 часов, когда микроорганизмами-мишенями являются дрожжи; и
по меньшей мере около 8 часов и не более чем около 36 часов, когда микроорганизмами-мишенями являются плесени.
2. Способ определения наличия или отсутствия микроорганизма в образце, включающий:
i) инкапсуляцию образца во множестве капель эмульсии типа "вода-в-масле", содержащих интеркалирующий краситель и не содержащих лизирующий агент, при этом капли эмульсии типа "вода-в-масле" дополнительно инкапсулируют микробиологическую питательную среду;
ii) определение капель эмульсии типа "вода-в-масле", содержащих микроорганизмы-мишени, путем обнаружения интеркалирующего красителя; и
iii) в результате идентификации микроорганизма-мишени по меньшей мере в одной капле эмульсии типа "вода-в-масле", определение того, что микроорганизм-мишень присутствует в образце.
3. Способ по п. 2, в котором:
капля типа «вода-в-масле» дополнительно содержит меченый белок;
капля типа «вода-в-масле» не содержит лизирующий агент; и
определение капель типа «вода-в-масле», содержащих микроорганизмы-мишени, включает в себя обнаружение меченого белка.
4. Способ по п. 3, в котором капля типа «вода-в-масле» дополнительно содержит бычий сывороточный альбумин.
5. Способ по п. 2, в котором образец представляет собой образец окружающей среды, образец воды из рекреационного водоема, образец с поверхности или клинический образец.
6. Способ быстрого анализа матрицы пищевых продуктов в отношении количества микроорганизмов-мишеней на единицу массы или объема, при этом способ включает в себя:
i) гомогенизацию части матрицы пищевых продуктов, при этом указанная часть матрицы имеет известную массу или объем;
ii) инкапсуляцию гомогенизированной матрицы во множестве капель эмульсии типа "вода-в-масле", при этом капли эмульсии типа "вода-в-масле" дополнительно инкапсулируют микробиологическую питательную среду;
iii) инкубацию множества капель эмульсии типа "вода-в-масле" при температуре, допускающей микробиологический рост, и в течение периода времени, достаточного для того, чтобы микроорганизмы-мишени удвоились от 5 до 45 раз;
iv) определение в инкубированных каплях эмульсии типа "вода-в-масле":
количества капель эмульсии типа "вода-в-масле", которые содержат микроорганизмы, посредством чего определяют количество положительных капель; и
количества капель эмульсии типа "вода-в-масле", которые не содержат микроорганизмов, посредством чего определяют количество отрицательных капель; и
v) определение по количеству положительных капель и отрицательных капель общего количества микроорганизмов-мишеней, посредством чего определяют количество микроорганизмов-мишеней на единицу массы или объема матрицы пищевых продуктов.
7. Способ по п. 6, в котором микроорганизмы-мишени выбирают из группы, состоящей из бактерий, дрожжей и плесени, и в котором инкубацию выполняют в течение периода времени, соответствующего:
по меньшей мере, около 4 часов и не более чем около 16 часов, когда микроорганизмами-мишенями являются бактерии;
по меньшей мере, около 6 часов и не более чем около 12 часов, когда микроорганизмами-мишенями являются дрожжи; и
по меньшей мере, около 8 часов и не более чем около 36 часов, когда микроорганизмами-мишенями являются плесени.
8. Способ по п. 6, в котором микробиологическая питательная среда содержит частично расщепленный белок.
9. Способ по п. 6, в котором микробиологическая питательная среда содержит: а) буферную пептонную воду (BAM Media M192) или b) сурфактант.
10. Способ по п. 9, в котором сурфактант представляет собой неионный сурфактант.
11. Способ по п. 10, в котором неионный сурфактант представляет собой полоксамер.
12. Способ по п. 11, в котором полоксамер имеет молекулярную массу около 1800 г/моль.
13. Способ по п. 12, в котором полоксамер содержит около 80% полиоксиэтилена.
14. Способ по п. 9, в котором микробиологическая питательная среда содержит сурфактант в концентрации, по меньшей мере, около 0,01% и не более около 5%.
15. Способ по п. 6, в котором перед инкубацией инкапсулированная микробиологическая питательная среда имеет рН около 7,2.
16. Способ по п. 6, в котором матрица пищевых продуктов содержит животный белок, молочный продукт, сыр, говяжий фарш, ветчину, непастеризованное молоко, растительный материал или от 20 до 45% жира.
17. Способ быстрого анализа микроорганизма-мишени в отношении минимальной подавляющей концентрации тестируемого противомикробного препарата, включающий:
i) инкапсуляцию множества микроорганизмов-мишеней во множестве капель эмульсии типа "вода-в-масле";
при этом капли эмульсии типа "вода-в-масле" дополнительно инкапсулируют микробиологическую питательную среду;
при этом:
a) первая часть капель типа «вода-в-масле» инкапсулирует тестируемый противомикробный препарат в первой концентрации или не инкапсулирует тестируемый противомикробный препарат;
b) вторая часть капель типа «вода-в-масле» инкапсулирует тестируемый противомикробный препарат во второй концентрации, отличной от первой концентрации;
ii) инкубацию множества капель эмульсии типа "вода-в-масле" при температуре, допускающей микробиологический рост, в отсутствие тестируемого противомикробного препарата и в течение периода времени, достаточного для того, чтобы микроорганизмы-мишени, если они не были ингибированы тестируемым противомикробным препаратом, поделились от 5 до 20 раз или более; и
iii) определение в каждой части инкубированных капель эмульсии типа "вода-в-масле":
первого количества капель эмульсии типа "вода-в-масле", которые содержат микроорганизм-мишень в количестве выше порогового, посредством чего определяют количество положительных капель; и
второго количества капель эмульсии типа "вода-в-масле", которые содержат микроорганизм-мишень в количестве ниже порогового, посредством чего определяют количество отрицательных капель; и
iv) по первому и второму количеству для каждой части капель, определение минимальной подавляющей концентрации тестируемого противомикробного препарата.
18. Способ по п. 17, в котором инкубацию выполняют в течение периода времени, соответствующего:
по меньшей мере, около 2 часов и не более чем около 8 часов, когда множество микроорганизмов-мишеней являются бактериями; или
по меньшей мере, около 4 часов и не более чем около 12 часов, когда множество микроорганизмов-мишеней являются дрожжами.
19. Способ по п. 17, в котором:
а) третья часть капель типа «вода-в-масле» инкапсулирует тестируемый противомикробный препарат в третьей концентрации;
b) четвертая часть капель типа «вода-в-масле» инкапсулирует тестируемый противомикробный препарат в четвертой концентрации;
c) пятая часть капель типа «вода-в-масле» инкапсулирует тестируемый противомикробный препарат в пятой концентрации; и
d) шестая часть капель типа «вода-в-масле» инкапсулирует тестируемый противомикробный препарат в шестой концентрации,
при этом первая, вторая, третья, четвертая, пятая и шестая концентрации тестируемого противомикробного препарата в каплях типа «вода-в-масле» охватывают диапазон концентраций, которые находятся и выше, и ниже минимальной подавляющей концентрации тестируемого противомикробного препарата.
20. Способ по п. 17, в котором тестируемый противомикробный препарат представляет собой β-лактамный антибиотик, аминогликозидный антибиотик, гликопептидный антибиотик, макролидный антибиотик, хинолоновый антибиотик, фторхинолоновый антибиотик, противогрибковый препарат на основе полиена, противогрибковый препарат на основе имидазола, противогрибковый препарат на основе триазола, противогрибковый препарат на основе тиазола, противогрибковый препарат на основе аллиламина, противогрибковый препарат на основе эхинокандинов или противогрибковый препарат на основе 5-фторцитозина.
21. Способ по п. 6, в котором капли эмульсии типа "вода-в-масле" дополнительно содержат чувствительный к рН флуоресцентный зонд, при этом чувствительный к pH флуоресцентный зонд является детектируемо флуоресцентным при длине волны обнаружения в водном растворе, имеющем рН менее чем около 5, и не является детектируемо флуоресцентным при длине волны обнаружения в водном растворе, имеющем рН более чем около 6,5.
22. Способ по п. 21, в котором определение количества положительных капель и определение количества отрицательных капель включает обнаружение флуоресценции чувствительного к рН флуоресцентного зонда во множестве капель типа «вода-в-масле», при этом количество положительных капель представляет собой количество капель, в которых обнаружена флуоресценция чувствительного к рН флуоресцентного зонда на длине волны обнаружения, а число отрицательных капель представляет собой количество капель, в которых флуоресценция чувствительного к рН флуоресцентного зонда на длине волны обнаружения не обнаружена.
23. Способ по п. 6, в котором определение количества положительных капель и определение количества отрицательных капель включает:
а) обнаружение автофлуоресценции во множестве капель типа «вода-в-масле», при этом количество положительных капель представляет собой количество капель, демонстрирующих наличие автофлуоресценции, а количество отрицательных капель представляет собой количество капель, демонстрирующих отсутствие автофлуоресценции;
b) обнаружение поглощения видимого света во множестве капель типа «вода-в-масле», при этом количество положительных капель представляет собой количество капель, демонстрирующих существенное поглощение видимого света во множестве капель типа «вода-в-масле», и количество отрицательных капель представляет собой количество капель, демонстрирующих отсутствие существенного поглощения видимого света; или
с) обнаружение наличия или отсутствия бактериальных спор, или гиф дрожжей или плесени, в каплях с помощью зрительной или компьютерной визуализации, при этом количество положительных капель представляет собой количество капель, демонстрирующих наличие бактериальных спор, или гиф дрожжей или плесени, во множестве капель типа «вода-в-масле», а количество отрицательных капель представляет собой количество капель, демонстрирующих отсутствие бактериальных спор, или гиф дрожжей или плесени, во множестве капель типа «вода-в-масле».
24. Способ по п. 6, в котором микробиологическая питательная среда содержит хромогенный, колориметрический или флуорогенный субстрат для фермента, продуцируемого микроорганизмами-мишенями, и в котором детектируют продукт реакции между субстратом и ферментом, продуцируемым микроорганизмами-мишенями.
25. Способ по п. 24, в котором микроорганизмы-мишени представляют собой:
а) колиформы, а субстрат представляет собой субстрат β-галактозидазы;
b) E. coli и/или Shigella, а субстрат представляет собой субстрат β-глюкуронидазы;
c) Listeria spp., Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter или Enterococci, или комбинацию указанного, а субстрат представляет собой субстрат β-глюкозидазы;
d) Chronobacter, а субстрат представляет собой субстрат α-галактозидазы;
e) Staphylococci или Enterococci, или комбинацию указанного, а субстрат представляет собой субстрат α-глюкозидазы;
f) Staphylococcus aureus, Enterobacteriaceae или Clostridium perfringens, или комбинацию указанного, а субстрат представляет собой субстрат фосфатазы;
g) Candida, и субстрат представляет собой субстрат N-ацетилглюкозаминидазы;
h) Salmonella, Campylobacter или Pseudomonas, или комбинацию указанного, а субстрат представляет собой субстрат эстеразы;
i) Pseudomonas, а субстрат представляет собой субстрат аминопептидазы; или
Listeria monocytogenes или Bacillus cereus, или комбинацию указанного, а субстрат представляет собой субстрат фосфолипазы.
26. Способ по п. 24, в котором субстрат является флуорогенным и подвергается внутримолекулярной конденсации альдола после расщепления ферментом микроорганизма-мишени, в результате чего продуцируется флуоресцентное индикаторное соединение.
27. Способ по п. 6, в котором определение количества положительных и отрицательных капель включает в себя сбор данных из капель, перемещаемых последовательно через область обнаружения устройства обнаружения.
28. Способ по п. 6, в котором определение количества положительных и отрицательных капелек включает в себя параллельную визуализацию множества капель типа «вода-в-масле».
29. Способ по п. 6, в котором определение количества положительных капель дополнительно включает в себя корректировку количества посредством применения поправки по распределению Пуассона для учета содержания нескольких микроорганизмов-мишеней в одной капле.
30. Способ по п. 17, в котором определение концентраций противомикробного средства в каждой капле типа «вода-в-масле» определяют в соответствии с градиентом.
31. Способ по п. 27, в котором микроорганизм-мишень представляет собой плесень, и масляная фаза содержит по меньшей мере один противогрибковый агент.
32. Способ по п. 31, в котором по меньшей мере один противогрибковый агент выбирают из группы, состоящей из 2,6-дихлор-4-нитроанилина, 4,5,6,7-тетрахлор-2',4',5',7'-тетрайодфлуоресцеина, (RS)-1-[2-(аллилокси)-2-(2,4-дихлорфенил)этил]-1Н-имидазола и хитозана.
33. Способ по п. 32, в котором:
а) концентрация 2,6-дихлор-4-нитроанилина находится в интервале от около 5 мг/л до около 200 мг/л;
b) концентрация 4,5,6,7-тетрахлор-2',4',5',7'-тетрайодфлуоресцеина составляет от около 50 мг/л до около 375 мг/л; или
с) концентрация (RS)-1-[2-(аллилокси)-2-(2,4-дихлорфенил)этил]-1Н-имидазола находится в диапазоне от около 0,1 до около 2,5 г/л.
34. Композиция, содержащая:
водные капли; и
масляную фазу, которая инкапсулирует каждую из водных капель, при этом масляная фаза содержит масло, фторсурфактант и противогрибковое средство.
Комментарии