Система редактирования генома дрожжей debaryomyces hansenii на основе crispr cas9

Чертежи

Описание

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано для экспрессии нуклеазы Cas9 в промышленно ценных штаммах Debaryomyces hansenii.

Эффективные генетические инструменты для манипуляции с геномами разработаны для всех хорошо изученных модельных организмов-продуцентов, таких как Escherichia coli или Saccharomyces cerevisiae. Несмотря на простоту генетических модификаций дрожжи S. cerevisiae не удобны для производства гетерологичных белков, это связано с относительно низкой эффективностью их систем внеклеточной секреции белков и нежелательным гипергликозилированием секретируемых белков, которое часто инактивирует эти белки. Поэтому в последние годы растёт интерес к так называемым «нетрадиционным» дрожжам, которые имеют специфичные особенности метаболизма, позволяющие преодолеть ряд трудностей в продукции гетерологичных белков. Одним из представителей «нетрадиционных» дрожжей является Debaryomyces hansenii.

Debaryomyces hansenii - это непатогенный, экстремофильный, маслянистый аскомицет, первоначально выделенный из морской воды и обычно встречающийся в условиях высокой осмотической и соленой среды [см. BREUER U, Harms H. (2006) Debaryomyces hansenii - an extremophilic yeast with biotechnological potential. Yeast 23: 415-437; Prista C. et al. (2016) The halotolerant Debaryomyces hansenii, the Cinderella of non-conventional yeasts. Yeast 33: 523-533].

Debaryomyces hansenii способны расти в экстремальных условиях, например, при высоких концентрациях NaCl, например, 10-25% NaCl [BUTINAR L. et al. (2005) Yeast diversity in hypersaline habitats. Fems Microbiol Lett 244: 229-234]), широком диапазоне температур 15-35°С [NAKASE T., Suzuki M (1985) Taxonomic studies on Debaryomyces hansenii (Zopf) Lodder et Kreger-van Rij and related species. I. Chemotaxonomic investigations. J Gen Appl Microbiol 31: 49-69.] и широком диапазоне рН от 3,0 до 10,0 [BREUER U., Harms H. (2006)].

Debaryomyces hansenii особенно известен своей ассоциацией с ферментацией мяса и сыров, а также производством тонких химических веществ, таких как ксилит и рибофлавин [BREUER U., HARMS H. (2006); PRISTA C. et al. (2016)]. Научный интерес к D. hansenii сосредоточен вокруг его осмотолерантности и галотолерантности, а также его экстремофильной и маслянистой природы [BANSAL P.K., Mondal A.K. Isolation and sequence of the HOG1 homologue from Debaryomyces hansenii by complementation of the hog1 Delta strain of Saccharomyces cerevisiae. Yeast 2000, 16: 81-88].

Подобные особенности обуславливают его важность при производстве некоторых пищевых продуктов, включая различные типы мясных и сырных продуктов, а также при производстве соевых соусов.

Применение в пищевой промышленности и многочисленные исследования данного вида дрожжей позволяют судить о безвредности в отношении здоровья человека, что дает возможность рассматривать его как перспективную экспрессионную системы и применять Debaryomyces hansenii в качестве продуцента ферментов [VIANA P. A. et al. "Debaryomyces hansenii UFV-1 Intracellular α-Galactosidase Characterization and Comparative Studies with the Extracellular Enzyme". Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(6), 2515-2522. doi:10.1021/jf8030919; NOBRE A. et al. "A physiological and enzymatic study of Debaryomyces hansenii growth on xylose- and oxygen-limited chemostats". Appl Microbiol Biotechnol., 2002, 59:509-516, DOI 10.1007/s00253-002-1050-4; CALAHORRA M. et al. "Activation of fermentation by salts in Debaryomyces hansenii". FEMS Yeast Res, 2009, 9, p.1293-1301, DOI:10.1111/j.1567-1364.2009.00556.x].

Применение Debaryomyces hansenii в биотехнологическом производстве затруднено из-за отсутствия эффективных генетических инструментов используемых при работе с геномом данных дрожжей.

Известно несколько плазмид, сконструированных для D. hansenii.

Плазмиды pMR95 и pMR96 были сконструированы с автономно реплицирующимися последовательностями (ARS), нативными для D. hansenii, идентифицированными с помощью скрининга геномной библиотеки в S. cerevisiae [GOVIND N.S., Banaszak A.T. (1992) Isolation and characterization of an autonomously replicating sequence (ARSD) from the marine yeast Debaryomyces hansenii. Mol Mar Biol Biotechnol 1: 215-218]. Плазмида pMR95 была сконструирована путем включения автономной системы репликации (ARS), гена устойчивости к бактериальному гигромицину B (hyg) и промотора и терминатора CYC1, происходящих из S. cerevisiae. В плазмиду pMR96 добавили ген S. cerevisiae URA3 в качестве прототрофного маркера. Частоты трансформации плазмид в D. hansenii были низкими при выборе для гена Hyg, поэтому требуются дальнейшие исследования для улучшения эффективности трансформации данных дрожжей [RICAURTE M.L., Govind N.S. (1999) Construction of plasmid vectors and transformation of the marine yeast Debaryomyces hansenii. Mar Biotechnol 1: 15-19].

Известна разработка системы трансформации для D. hansenii, которая основана на гистидиновом ауксотрофном штамме реципиента и гене DhHIS4 в качестве селектируемого маркера. Две плазмиды, pGEM-HIS4 и pDhARS2, были сконструированы на основе использования ARS от D. hansenii. Плазмиду pDhARS2 использовали в качестве основы для конструирования восьми плазмид с различными ARS, три из которых, pDhARS2, pDhARS3 и pDhARS9, показали эффективную трансформацию. Две плазмиды, pDH4 и pDH11, были сконструированы с геном DhHIS4, а также с ARS, происходящим из D. hansenii. Это исследование впервые продемонстрировало нарушение генов у D. hansenii путем гомологичной рекомбинации [MINHAS A, et al. (2009) Development of host and vector for high-efficiency transformation and gene disruption in Debaryomyces hansenii. FEMS Yeast Res 9: 95-102].

Шесть эписомальных экспрессирующих векторов для D. hansenii были сконструированы с использованием терминатора, производного от S. cerevisiae, пять из шести векторов были сконструированы с индуцибельными гетерологичными промоторами из S. cerevisiae, а конечный вектор был сконструирован с эндогенным промотором D. hansenii. Все векторы имели ORI E. coli, ген bla, ауксотрофный маркер урацила URA3, ARS из D. hansenii и репортер GFPm3.1. Наивысшие уровни экспрессии GFP были достигнуты с промотором GPD1 из D. hansenii в среде с 6% NaCl. В дополнение к высокому уровню экспрессии, достигнутому c промотором GPD1d, у D. hansenii был обнаружен низкий уровень секретируемого белка. 5-кратное снижение флуоресценции относительно общего уровня белка произошло во внеклеточной фракции GFP D. hansenii [MAGGI R.G., Govind N.S. (2004) Regulated expression of green fluorescent protein in Debaryomyces hansenii. J Ind Microbiol Biot 31: 301-310].

Известен интегративный вектор экспрессии, первоначально разработанный для Arxula adeninivorans, который был применен для трансформации множества видов дрожжей, включая D. hansenii. Вектор содержит консервативную последовательность 25S рДНК, полученную из A. adeninivorans, для нацеливания, промотор TEF1, полученный из A. adeninivorans, для контроля экспрессии репортерной последовательности, и ген hph, полученный из Escherichia coli, придающий устойчивость к гигромицину B, для отбора рекомбинантов. Экспрессию гетерологичного гена оценивали с использованием репортерного гена зеленого флуоресцентного белка (GFP). Хотя интеграция генов была успешной, D. hansenii продемонстрировал самый слабый сигнал экспрессии GFP [TERENTIEV Y. et al. (2004) A wide-range integrative yeast expression vector system based on Arxula adeninivorans-derived elements. J Ind Microbiol Biotechnol 31: 223-228].

Эти исследования подчеркивают необходимость дополнительной оптимизации и расширения генетического инструментария для D. hansenii.

Одной из причин отсутствия эффективных методов манипуляции с геномной ДНК in vivo для D. hansenii являются отклонения от стандартного генетического кода у этих дрожжей. Так, кодон CTG обычно кодирует лейцин, однако, у D. hansenii он кодирует серин. Таким образом, актуальна проблема создания методов геномной инженерии D. hansenii, которые могут значительно ускорить его исследования и реализацию его биотехнологического потенциала.

В целях детального исследования физиологических процессов дрожжевых клеток для получения новых штаммов продуцентов, создания новых лекарственных средств разрабатываются новые инструменты генной и геномной инженерии дрожжей. Одним из таких инструментов стала система CRISPR/Cas9 из бактерий Streptococcus pyogenes. С помощью этой системы повысилась эффективность внесения изменений в геном дрожжей, а также расширился набор вносимых изменений. Система CRISPR/Cas9 адаптирована к редактированию геномов различных видов дрожжей: Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris, Candida albicans, Candida glabrata, Schizosaccharomyces pombe и других [RASCHMANOVÁ H., et al. Implementing CRISPR-Cas technologies in conventional and non-conventional yeasts: Current state and future prospects. Biotechnology Advances 36 (2018) 641-665].

При разработке системы CRISPR/Cas9 для редактирования данного вида дрожжей учитываются особенности его генетического кода, частота использования кодонов, отбираются наиболее сильные промоторы для высокой экспрессии компонентов системы. Выбираются способы искусственного процессинга химерного транскрипта, состоящего из нескольких направляющих РНК. Отдельное внимание уделяется контролю активностей клеточных систем репарации ДНК, чтобы повысить эффективность внесения интересующего типа изменения в геном.

Известна конструкция нуклеиновой кислоты, способная осуществлять конститутивную экспрессию Cas9 в дрожжах. Конструкция нуклеиновой кислоты содержит дрожжевой промотор Tef1, оперативно связанный с геном Cas9, источник репликации от pBR322 и его метку скрининга, а также область репликации от CEN6ARS4 и метку скрининга. Конструкция нуклеиновой кислоты находится в форме репликации одной копии в дрожжах и многокопийной репликации в Escherichia coli (CN106480083 A, 08.03.2017). В указанной заявке не сообщается об использовании конструкции в дрожжах Debaryomyces hansenii для экспрессии Cas9.

Наиболее близким к заявленным изобретениям является модификация генома дрожжевой клетки Candida, включающая: а) введение в дрожжевую клетку первой нуклеиновой кислоты, содержащей совместимую с Candida CRISPR/Cas9 нуклеотидную последовательность (CaCas9); б) введение в дрожжевую клетку второй нуклеиновой кислоты, содержащей кодирующую последовательность sgRNA; и с) экспрессию кодирующих последовательностей CaCas9 и sgRNA в дрожжевой клетке, тем самым модифицируя геном дрожжевой клетки. Система CaCas9 обеспечивает высокоэффективный мутагенез у Candida (US 2017166928 A1, 15.06.2017).

В заявке US 2017166928 не сообщается о мутагенезе Debaryomyces hansenii с использованием CaCas9.

Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок авторам не известно создание и использование генетических конструкций на базе системы CRISPR/Cas9 для редактирования генома Debaryomyces hansenii.

Задачей заявленной группы изобретений является разработка CRISPR/Cas9 системы редактирования генома D. hansenii, которая позволяет получить мутанты, экспрессирующие нуклеазу Cas9.

Решение поставленной задачи достигается тем, что получают генетическую конструкцию pDhCas9sgRNA (фиг.1, SEQ ID NO.1) на основе системы редактирования генома CRISPR/Cas9, которая кодирует нуклеазу Сas9, экспрессируемую в клетке Debaryomyces hansenii и специфически транспортируемую в клеточное ядро.

Изобретение обеспечивает синтез нуклеазы Cas9 в дрожжах Debaryomyces hansenii и эффективное редактирование хромосомальной ДНК.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм и среды.

Все эксперименты проводились на штамме Debaryomyces hansenii Y-3014 (http://vkpm.genetika.ru/katalog-mikroorganizmov/cat3002516002721/).

Штаммы наращивались на жидкой среде YPD (10 г/л дрожжевой экстракт, 20 г/л пептона, 20 г/л глюкоза). В качестве твёрдой среды использовалась агаризованная среда YPDa (YPD + 2% агароза). Трансформанты рассевались на среде YPDa с добавление 1М сорбитола и гигромицина 200 мкг/мл.

Генетическая конструкция на основе системы редактирования генома CRISPR/Cas9, кодирующая нуклеазу Cas9, специфически импортируемую в клетки D. hansenii Y-3014, представляет собой плазмиду pDhCas9sgRNA (фиг.1, SEQ ID NO.1), разработанную на базе вектора pUC19 (Invitrogen).

Конструкция плазмиды pDhCas9sgRNA (фиг.1) содержит:

• pDhGPP1 - промотор Cas9 1 п.н. - 800 п.н. из D. hansenii,

• Cas9 - нуклеаза Cas9 801 п.н. - 4940 п.н. Streptococcus pyogenes,

• tADH1 - терминатор 4941 п.н. - 5129 п.н. взят из генома Saccharomyces cerevisiae,

• SpeI - нуклаза рестрикции 5190 п.н. (#ER1251 Thermo Scientific),

• pUC - ориджин репликации E. Coli 5269 п.н. - 5857 п.н.,

• AmpR - ген устойчивости к ампициллину 6031 п.н. - 6888 п.н., pUC и AmpR часть идёт из плазмиды pUC19,

• NsiI - нуклаза рестрикции 7093 п.н. (#ER0731 Thermo Scientific),

• DhARS3 - автореплицирующаяся последовательность 7095 п.н. - 8085 п.н из генома D. hansenii,

• pSCR1 - промотор РНК-субъединицы распознавания сигнала SRP 8087 п.н. - 8232 п.н D. hansenii,

• BbsI - нуклаза рестрикции, сайты лигирования спейсеров 8305 п.н., 8334 п.н. (#ER1011 Thermo Scientific),

• gRNA-block - гидовая (направляющая) РНК 8233 п.н. - 8430 п.н. стандартная синтетическая последовательность sgRNA,

• pHIS4 - гистидиновый промотор 8659 п.н. - 8840 п.н. из D. hansenii.

• HygR - ген устойчивости к гигромицину 8841 п.н. - 9863 п.н. ген устойчивости к гигромицину E. сoli,

• tBDE - терминатор 4-бутандиол диакрилатэстеразы 9864 п.н. - 10029 п.н из генома D. hansenii.

Техническим результатом изобретения является получение системы, позволяющей редактировать геном D. hansenii c эффективностью от 45 до 95%.

Достижение технического результата обусловлено следующим:

1. получением рекомбинантного штамма дрожжей D. hansenii путем трансформации плазмидой pDhCas9sgRNA (фиг.1, SEQ ID NO.1) нативного штамма дрожжей Debaryomyces hansenii Y-3014.

2. оптимизацией элементов плазмиды pDhCas9sgRNA для дрожжей D. hansenii.

Перечень фигур:

Фиг. 1. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pDhCas9sgRNA.

Фиг. 2. представляет собой фото чашки, содержащей флюоротовую кислоту, где WT- дикий штамм, Δ1 - мутант №1, Δ2 - мутант №2, Δ3 - мутант №3.

Фиг. 3. демонстрирует участок, в котором произошла делеция, что подтверждается при наложении на последовательность гена URA3 дикого штамма.

Фиг. 4. показывает, что колонии, содержащие делеции, не окрашиваются в синий цвет. Количество мутантов составляет от 40 до 60%. WT- дикий штамм, Δ1 - мутант №1, Δ2 - мутант №2, Δ3 - мутант №3.

Фиг. 5. демонстрирует участок, в котором произошла делеция, что подтверждается при наложении на последовательность гена дикого штамма.

Осуществление изобретения

Пример 1. Получение рекомбинантной плазмиды pDhCas9sgRNA с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO. 1.

Плазмида включает функциональную нуклеазу Cas9, имеющую последовательность аминокислот, как представлено в SEQ ID NO. 2 или в SEQ ID NO. 3 положения 801..4940.

Функциональная часть CRISPR/Cas9 системы включала в себя ориджин репликации DhARS3) (A. MINHAS et al. Developmentof host and vector for high-efciency transformation and gene disruption inDebaryomyces hansenii. FEMS Yeast Research, 2009, v.9, Issue 1, pp.95-102).

В качестве маркёра использовался ген резистентности к гигромицину под промотором гена гистидина pHIS4 D. hansenii, терминатор был взят от гена 4-бутандиол диакрилат эстераза (D. hansenii) tBDE. Промотор для Cas9 был так же взят из нативного генома D. hansenii от гена галактозы-1-фосфат фосфатазы (pDhGPP1). Терминатор для Cas-белка был взят от гена алкогольдегидрогеназы (tADH1).

Синтез функциональной части системы Cas9 был заказан у GenScript.

После получения образца ДНК-и, лиофилизат был восстановлен в воде mQ. Далее для клонирования данного участка в вектор pUC19 с праймерами DhCas9_F и DhCas9_R был поставлена полимеразная цепная реакция с Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (# M0530S, NEB). После наработки участка функциональной части Cas9, ампликон был почищен на колонке GeneJET PCR Purification Kit фирмы Thermo Scientific. Для линирезации pUC19 (#SD0061 Thermo Scientific), использовали рестриктазы SpeI (#ER1251 Thermo Scientific) и NsiI (#ER0731 Thermo Scientific). Теми же рестриктазами подготавливали и концы ДНК у ампликона с функциональной частью Cas9-системы.

Далее смешивали линерезованную плазмиду и подготовленный ампликон и ставили лигирование с T4 DNA Ligase (#EL0014 Thermo Scientific). Через час лигазной смесью трансформировали компетентные клетки NEB Turbo (C2984I, NEB https://international.neb.com/products/c2984-neb-turbo-competent-e-coli-high-efficiency#Product%20Information) методом Heat Shock (https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/). Полученные трансформанты высевали на чашки Петри с ампицилином. Для наработки плазмиды трансформанты растили на жидкой среде LB с ампицилином и выделяли с помощью GeneJET Plasmid Miniprep Kit (#K0502, Thermo Scientific).

Праймеры для клонирования участка Cas9 в pUC19:

DhCas9_F с сайтом рестрикции SpeI:

5' - ATATAACTAGTAACGCAGGAAAGAACATG

DhCas9_R с сайтом рестрикции NsiI:

5' - ATATAATGCATACGAAAGGGCCTCGTG.

Для получения «заряженной» системы pDhCas9sgRNA (т.е. системы с лигированными в неё спейсерами): в плазмиду pDhCas9sgRNA спейсеры лигировали по сайтам BbsI (ER1011 Thermo Scientific).

Праймеры для спейсеров (участки мишени для действия нуклеазы):

Δ1_URA3_F:

5' - TGCGCAGAGGAACAACAGTACCTTCGT

Δ1_URA3_R:

5' - AAACACGAAGGTACTGTTGTTCCTCTG

Δ2_URA3_F:

5' - TTGCGCAGAGGTACTGTTGTTCCTTTAT

Δ2_URA3_R:

5' - AAACATAAAGGAACAACAGTACCTCTG

Δ3_URA3_F:

5' - TGCGCAGCGGCCCTAATTTCTCTATTA

Δ3_URA3_R:

5' - AAACTAATAGAGAAATTAGGGCCGCTG

Δ1_αGal1_F:

5' - TGCGCAGGTAGAAAATGGGTCTTCCAG

Δ1_αGal1_R:

5' - AAACCTGGAAGACCCATTTTCTACCTG

Δ2_αGal2_F:

5' - TGCGCAGCGTAGGCTTGTGTAGAACCA

Δ2_αGal2_R:

5' - AAACTGGTTCTACACAAGCCTACGCTG

Δ3_αGal3_F:

5' - TGCGCAGCAGCGCAAATCAGCTATAAG

Δ3_αGal3_R:

5' - AAACCTTATAGCTGATTTGCGCTGCTG.

Пример 2. Трансформация D. hansenii плазмидой pDhCas9sgRNA.

Методика трансформации сферопласт D. hansenii, была модифицирована из описанной ранее для Candida famata (VORONOVSKY A. A. et al. Development of a transformation system for the flavinogenic yeast Candida famata, FEMS Yeast Research 2 (2002), pp. 203-253). Свежеразмузееные клетки растили на среде YPD до образования моноколоний, далее переносили и инокулировали в 3 мл YPD, культивирование проходило при аэрации приблизительно 24 ч при 28°С. После, доращивая до 0,4-0,8 при OD600, клетки были собраны центрифугированием, 5000 об/минуту 5 минут. Далее клетки отмывали в равном объёме буфера A (1M cахароза, 25 мМ ЭДТА, 50 мМ дитиотритола). После осаждения клетки промывали 1М сахарозой и далее осадок ресуспензировали в буфере Б (1М сахароза, 0,1М цитрат натрия рН 5,8, 10 мМ ЭДТА). Клетки перемешивали с добавлением литиказы (1000 U на 20 мг сухого веса клеток) и выдерживали 1 час при 30°С. Сферопласты собирали при 750g в течение 10 минут. Затем сферопласты промывали 1М раствором сахарозы и один раз буфером В (10 мМ CaCL₂, 1М сахарозы, 10 мМ Трис-HCl рН 7,5) далее осадок ресуспензировали в 0,5 мл буфера В. К 100 мкл сферопластов добавляли 5 мкг плазмиды pDhCas9sgRNA и выдерживали при комнатной темпертуре (22-25°C) 15 минут. Далее добавляли 1 мл 20% PEG3350 c 10 мМ CaCl₂ и оставили при комнатной температуре на 10 минут. После центрифугирования при 750g в течение 5 минут осадок ресуспензировали в 150 мкл среды SOS (YPD, 1M сахарозы). Далее оставляли при комнатной темпертуре (22-25°C) в течение 20 минут и далее рассевали 100-200 мкл на чашки Петри. Трансформанты росли в течение 4-6 дней при температуре 28°С.

Пример 3. Подтверждение трансформация D. hansenii и экспрессии Cas9.

Действие нуклеазы Cas9 и её работу можно детектировать при действии её на ДНК и соответствующим изменениям свойств штамма D. hansenii. Экспрессия целевого гена подтверждается делецией и изменением свойств исследуемого штамма.

Штаммы наращивались на жидкой среде YPD (10 г/л дрожжевой экстракт, 20 г/л пептона, 20 г/л глюкоза). В качестве твёрдой среды использовалась агаризованная среда YPDa (YPD + 2% агароза). Трансформанты рассевались на среде YPDa с добавление 1М сорбитола и гигромицина 200 мкг/мл.

Выделение ДНК для передачи на секвенирование.

Для оценки эффективности редактирования CRISPR/Cas9-системой дрожжей D. hansenii методом секвенирования была выделена ДНК при помощи набора GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific). В качестве лизирующего агента дрожжей использовалась литиказа (Lyticase from Arthrobacter luteus, Sigma).

Для секвенирования использовались праймеры:

URA3_seq_F:

5' - GGTTAAAACCCAAACGTACAC

URA3_seq_R:

5' - CCAGTCTTCTTTAAATATGC

α-Gal_seq_F:

5' - CTTGCAGCTATCTCGACGC

α-Gal _seq_R:

5' - TACCCAAGTCTTCGTCAGT.

Для проверки делеции в гене URA3 использовалась методика с 5-флюоротовой кислотой (Sigma #F5013) (D. BOEKE et al. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 1987, v. 154, pp.164-175). Мутанты, имеющие делеции в гене URA3 лишаются активности оротидин-5'-фосфатдекарбоксилазы, в связи с чем свободно растут на среде содержащей флуоротовую кислоту (YPDa + 0,5мкг флюоротовой кислоты).

Разработанные спейсеры (регионы направляющей РНК (gRNA), комплементарные участку ДНК мишени) позволили получить мутанты и привели к потере активности гена URA3.

Подтверждение делеции нуклеотидов было получено при помощи секвенирования:

Результаты представлены на фиг.2 и 3. Фигура 2 представляет собой фото чашки содержащей флюоротовую кислоту, где WT- дикий штамм, Δ1 - мутант №1, Δ2 - мутант №2, Δ3 - мутант №3. Количество мутантов составляет от 40 до 60 процентов. Фигура 3 демонстрирует участок, в котором произошла делеция, что подтверждается при наложении на ДНК дикого штамма.

Проверка делеции в гене альфа-галактозидазы проводилась по методике описанной в статье AHO S. et al. (AHO S. et al. Novel Reporter GeneMEL1for the Yeast Two-Hybrid System, Analytical Biochemistry. 1997, v. 253, Issue 2, pp. 270-272).

Определение активности альфа-галактозидазы детектировали на среде YPSLa (10 г/л дрожжевой экстракт, 20 г/л пептона, 20 г/л лактоза, 2% агароза + X-α-Gal (Sigma #16555)).

Мутанты, имеющие делеции в гене альфа-галактозидазы лишаются её активности, вследствие чего перестают расщеплять X-α-Gal.

Разработанные спейсеры позволили получить мутанты и привели к потере активности гена X-α-Gal.

Подтверждение делеции нуклеотидов было получено при помощи секвенирования.

Результаты представлены на фиг.4 и 5.

При создании мутантов по гену альфа-амилазы получаются колонии неспособные гидролизовать X-α-Gal, вследствие чего не происходит окраска колоний в синий цвет. На фиг. 4 видно, сколько колоний окрасилось в синий цвет (дикие штаммы без мутаций) и белые колонии - колонии, имеющие мутации в гене альфа-амилазы, приведшие к потере функции данного фермента. На фиг. 4 видно, что количество мутантов составляет от 40 до 60%. Фигура 5 демонстрирует участок, в котором произошла делеция, что подтверждается при наложении на ДНК дикого штамма.

Таким образом, подтверждена трансформация D. hansenii плазмидой pDhCas9sgRNA на основе системы CRISPR/Cas9 и экспрессия Cas9 в клетках дрожжей.

--->

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<110> ssnab

<120> СИСТЕМA РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА ДРОЖЖЕЙ DEBARYOMYCES HANSENII НА ОСНОВЕ CRISPR/CAS9

<160> 4

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 10071

<212> DNA

<213> Debaryomyces hansenii

<220>

<223> pDhCas9sgRNA

<400> 1

ttattcctcc tttgggcctg tatcatggtc tttaagaatc ataggacatt ttactcgttc 60

ccattgggcc agtactgtac caacactgtg cccacaatag atccagaatt attgtcgtcg 120

catgcgtcct tactaccgta cgtatatgtt ctagagtagt atccaactcg tacctctaga 180

ctacgagaga tccatcacaa atccgtggta gttccacaga tccaagaggt ccaagaaaat 240

taaacctaat tttgacacca gcgctgctat cgtttttccg atcttcactg taatatcgag 300

ctatcgtggg tattctcgtg gtccttctaa aaccgttgca agcggttttt aaccacaaaa 360

agaaataatg gaacaatttc caaaagaaat aaaattacaa aatcaaccgt gaattacccg 420

ttttggtcaa tttgtttccg atcaattacg taataggttt tttatttctg ttggccacaa 480

taccaccgga acataacttt acacttttag agcgtattat atggtaacat accggaatca 540

agcgtatata gcgcatcaaa agcatcgtta cgtaatagaa ttttcaagaa aatggcgtta 600

cgtaataaga tgatgataac caaaaaaaaa aatcgtatgc tagagtagta cattcagata 660

gctagacatt tctttttgtt gaaggaaata attgatgaat ataaataccg tggtaatccc 720

tgttacaatg gataaataaa atatatattt ttacagtatt caatactttc attaatacaa 780

acataataaa ataaattaca atggacaaga agtactccat cggactcgac atcggaacca 840

actccgtcgg atgggccgtc atcaccgacg agtacaaggt cccatccaag aagttcaagg 900

tcctcggaaa caccgaccgt cactccatca agaagaacct catcggagcc ctcctcttcg 960

actccggaga gaccgccgag gccacccgtc tcaagcgtac cgcccgtcgt cgttacaccc 1020

gtcgtaagaa ccgtatctgc tacctccagg agatcttctc caacgagatg gccaaggtcg 1080

acgactcctt cttccaccgt ctcgaggagt ccttcctcgt cgaggaggac aagaagcacg 1140

agcgtcaccc aatcttcgga aacatcgtcg acgaggtcgc ctaccacgag aagtacccaa 1200

ccatctacca cctccgtaag aagctcgtcg actccaccga caaggccgac ctccgtctca 1260

tctacctcgc cctcgcccac atgatcaagt tccgtggaca cttcctcatc gagggagacc 1320

tcaacccaga caactccgac gtcgacaagc tcttcatcca gctcgtccag acctacaacc 1380

agctcttcga ggagaaccca atcaacgcct ccggagtcga cgccaaggcc atcctctccg 1440

cccgtctctc caagtcccgt cgtctcgaga acctcatcgc ccagctccca ggagagaaga 1500

agaacggact cttcggaaac ctcatcgccc tctccctcgg actcacccca aacttcaagt 1560

ccaacttcga cctcgccgag gacgccaagc tccagctctc caaggacacc tacgacgacg 1620

acctcgacaa cctcctcgcc cagatcggag accagtacgc cgacctcttc ctcgccgcca 1680

agaacctctc cgacgccatc ctcctctccg acatcctccg tgtcaacacc gagatcacca 1740

aggccccact ctccgcctcc atgatcaagc gttacgacga gcaccaccag gacctcaccc 1800

tcctcaaggc cctcgtccgt cagcagctcc cagagaagta caaggagatc ttcttcgacc 1860

agtccaagaa cggatacgcc ggatacatcg acggaggagc ctcccaggag gagttctaca 1920

agttcatcaa gccaatcctc gagaagatgg acggaaccga ggagctcctc gtcaagctca 1980

accgtgagga cctcctccgt aagcagcgta ccttcgacaa cggatccatc ccacaccaga 2040

tccacctcgg agagctccac gccatcctcc gtcgtcagga ggacttctac ccattcctca 2100

aggacaaccg tgagaagatc gagaagatcc tcaccttccg tatcccatac tacgtcggac 2160

cactcgcccg tggaaactcc cgtttcgcct ggatgacccg taagtccgag gagaccatca 2220

ccccttggaa cttcgaggag gtcgtcgaca agggagcctc cgcccagtcc ttcatcgagc 2280

gtatgaccaa cttcgacaag aacctcccaa acgagaaggt cctcccaaag cactccctcc 2340

tctacgagta cttcaccgtc tacaacgagc tcaccaaggt caagtacgtc accgagggaa 2400

tgcgtaagcc agccttcctc tccggagagc agaagaaggc catcgtcgac ctcctcttca 2460

agaccaaccg taaggtcacc gtcaagcagc tcaaggagga ctacttcaag aagatcgagt 2520

gcttcgactc cgtcgagatc tccggagtcg aggaccgttt caacgcctcc ctcggaacct 2580

accacgacct cctcaagatc atcaaggaca aggacttcct cgacaacgag gagaacgagg 2640

acatcctcga ggacatcgtc ctcaccctca ccctcttcga ggaccgtgag atgatcgagg 2700

agcgtctcaa gacctacgcc cacctcttcg acgacaaggt catgaagcag ctcaagcgtc 2760

gtcgttacac cggatgggga cgtctctccc gtaagctcat caacggaatc cgtgacaagc 2820

agtccggaaa gaccatcctc gacttcctca agtccgacgg attcgccaac cgtaacttca 2880

tgcagctcat ccacgacgac tccctcacct tcaaggagga catccagaag gcccaggtct 2940

ccggacaggg agactccctc cacgagcaca tcgccaacct cgccggatcc ccagccatca 3000

agaagggaat cctccagacc gtcaaggtcg tcgacgagct cgtcaaggtc atgggacgtc 3060

acaagccaga gaacatcgtc atcgagatgg cccgtgagaa ccagaccacc cagaagggac 3120

agaagaactc ccgtgagcgt atgaagcgta tcgaggaggg aatcaaggag ctcggatccc 3180

agatcctcaa ggagcaccca gtcgagaaca cccagctcca gaacgagaag ctctacctct 3240

actacctcca gaacggacgt gacatgtacg tcgaccagga gctcgacatc aaccgtctct 3300

ccgactacga cgtcgaccac atcgtcccac agtccttcct caaggacgac tccatcgaca 3360

acaaggtcct cacccgttcc gacaagaacc gtggaaagtc cgacaacgtc ccatccgagg 3420

aggtcgtcaa gaagatgaag aactactggc gtcagctcct caacgccaag ctcatcaccc 3480

agcgtaagtt cgacaacctc accaaggccg agcgtggagg actctccgag ctcgacaagg 3540

ccggattcat caagcgtcag ctcgtcgaga cccgtcagat caccaagcac gtcgcccaga 3600

tcctcgactc ccgtatgaac accaagtacg acgagaacga caagctcatc cgtgaggtca 3660

aggtcatcac cctcaagtcc aagctcgtct ccgacttccg taaggacttc cagttctaca 3720

aggtccgtga gatcaacaac taccaccacg cccacgacgc ctacctcaac gccgtcgtcg 3780

gaaccgccct catcaagaag tacccaaagc tcgagtccga gttcgtctac ggagactaca 3840

aggtctacga cgtccgtaag atgatcgcca agtccgagca ggagatcgga aaggccaccg 3900

ccaagtactt cttctactcc aacatcatga acttcttcaa gaccgagatc accctcgcca 3960

acggagagat ccgtaagcgt ccactcatcg agaccaacgg agagaccgga gagatcgtct 4020

gggacaaggg acgtgacttc gccaccgtcc gtaaggtcct ctccatgcca caggtcaaca 4080

tcgtcaagaa aaccgaggtc cagaccggag gattctccaa ggagtccatc ctcccaaagc 4140

gtaactccga caagctcatc gcccgtaaga aggactggga cccaaagaag tacggaggat 4200

tcgactcccc aaccgtcgcc tactccgtcc tcgtcgtcgc caaggtcgag aagggaaagt 4260

ccaagaagct caagtccgtc aaggagctcc tcggaatcac catcatggag cgttcctcct 4320

tcgagaagaa cccaatcgac ttcctcgagg ccaagggata caaggaggtc aagaaggacc 4380

tcatcatcaa gctcccaaag tactccctct tcgagctcga gaacggacgt aagcgtatgc 4440

tcgcctccgc cggagagctc cagaagggaa acgagctcgc cctcccatcc aagtacgtca 4500

acttcctcta cctcgcctcc cactacgaga agctcaaggg atccccagag gacaacgagc 4560

agaagcagct cttcgtcgag cagcacaagc actacctcga cgagatcatc gagcagatct 4620

ccgagttctc caagcgtgtc atcctcgccg acgccaacct cgacaaggtc ctctccgcct 4680

acaacaagca ccgtgacaag ccaatccgtg agcaggccga gaacatcatc cacctcttca 4740

ccctcaccaa cctcggagcc ccagccgcct tcaagtactt cgacaccacc atcgaccgta 4800

agcgttacac ctccaccaag gaggtcctcg acgccaccct catccaccag tccatcaccg 4860

gactctacga gacccgtatc gacctctccc agctcggagg agactcccgt gccgacccaa 4920

agaagaagcg taaggtctga agcgaatttc ttatgattta tgatttttat tattaaataa 4980

gttataaaaa aaataagtgt atacaaattt taaagtgact cttaggtttt aaaacgaaaa 5040

ttcttattct tgagtaactc tttcctgtag gtcaggttgc tttctcaggt atagtatgag 5100

gtcgctctta ttgaccacac ctctaccggt ctagacccta gaggctcact caaaggcggt 5160

aatacggtta tccacagaat caggggatac tagtaacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 5220

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 5280

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 5340

aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 5400

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 5460

tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 5520

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 5580

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 5640

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 5700

cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 5760

agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 5820

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 5880

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 5940

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 6000

tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 6060

agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 6120

gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 6180

accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 6240

tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 6300

tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 6360

acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 6420

atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 6480

aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 6540

tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 6600

agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 6660

gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 6720

ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 6780

atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 6840

tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt 6900

tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 6960

tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 7020

cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc 7080

ctttcgtatg catatgaaac acatggaccc aatgactgaa taaagttatt tgacttcatg 7140

aatttaaacc aatgatttac tgtatcttgt tgtatgtttg ggttttgaac gagcaattca 7200

gtcaatattt tcatctgatc aataattaga agatgacttt ccgtatttat tatctcatct 7260

aatgagtctg aaacccccgt aataaatgat ctattcgcaa ctgatttgat caattcttcg 7320

aggctattta ttaaatcatt ggtgtatgtt ttagaaagat atatctcctt tcccaagttc 7380

tgaatagtcg acgaagtttc tgaattagat ttattgttta acaattcaat aaccaagcga 7440

agaactattc ttctttctct caatactctg ctggaataaa gcaaaattct ttcttcttct 7500

agatattttt ctctatcatc tggcaatttg gattttaatt tttcataatt ataaaccttt 7560

ctttcaggga tccgtttaca agtttggctt attactctca acacatcgtt gtaatctaaa 7620

ttcaaaacat tacttatggt ttcggcgtct ttaatattat ttggtgttat gtctgaatat 7680

aaaatattac gcaacgataa ttctttagcc tccttattag gacttttggt cacacgttta 7740

aacggtaatg gattcaacaa tagcttactg tttagaagta gaaattcatc taatgcaaca 7800

agaatatatg ggtcttgata tgatttcaat aatgaaaggg cattgtcgaa tccccataat 7860

tgagtaggtt gaatgggttt caaaggttta acttccttgg ccgcctttag ctctacggta 7920

gaaacaggca tattcaaacc tttaggaata tctctttata gtacggatct gatattggat 7980

atcttttacg ctgttgctta tatgtttttg tttcgatgtg tgagatggtg gaaatttttg 8040

acttcctaaa tcggaaataa ctgcgaaatg gaaatacaac cctaccatat cagaccgaac 8100

atatctcact ttttttcatt tttctatgct gtgatggcgt atggcagaag cgcgcagatt 8160

gtgtactttt gattctttat tacagtttaa gtgtccggtt cgatctctgc ggtcgcaaac 8220

ttgtgaattt gaacaattag cgcaaatggt ttagtggtaa aatccaacgt tgccatcgtt 8280

gggcccccgg ttcgattccg ggtttgcgca gtcttctggt acccagaaga cctgttttag 8340

agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg 8400

agtcggtggt gctttttttg ttttttatgt aatatcggtt gttacaaaga agcagcggaa 8460

catttactta gtggcttatc aatgcaccaa gtcgaaggag ttcaaacgga tgcgtcaagc 8520

acgctaaacc ataatcaatc gacttccttg acagaaactt tgaagagagc ttttattgca 8580

ttggatcgca gagatttgtt ggagaaggtc aaacctgaca tggatataaa tcaattcaga 8640

ggtgaattta gcttttaaga ggttgcagat gttcttagta catagtaata acatgaaaat 8700

ggtcaggtga ccaccatgac tcagtctaaa attttctcaa aagatactgg agcatagata 8760

aaagatagtt gaagttagcg gttaatatta gtagtataca tttccgataa atataagaga 8820

taaatctgta ttagtataat atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt 8880

ttctaatcga aaagttcgac agcgtctccg acctaatgca gctctcggag ggcgaagaat 8940

ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt cctacgggta aatagctgcg 9000

ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga 9060

ttccggaagt gcttgacatt ggggagttta gcgagagcct aacctattgc atctcccgcc 9120

gtgcacaggg tgtcacgttg caagacctac ctgaaaccga actacccgct gttctacaac 9180

cggtcgcgga ggctatggat gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg 9240

gcccattcgg accgcaagga atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga 9300

ttgctgatcc ccatgtgtat cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg 9360

tcgcgcaggc tctcgatgag ctaatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc 9420

tcgtgcacgc ggatttcggc tccaacaatg tcctaacgga caatggccgc ataacagcgg 9480

tcattgactg gagcgaggcg atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct 9540

tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc 9600

cggagcttgc aggatcgcca cgactccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac 9660

tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg 9720

acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg 9780

cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca 9840

gcactcgtcc gagggcaaag aaataatgta actaagtacc aagtttagag taatcttgta 9900

tagacaaaat atatttaatt aagcgtatgc taactttatt atatagttct gctggtcaac 9960

aaaaattagt agttaaaaat cttgaatcat attagttcta taatttggat ttggttgact 10020

cttctctagg ggctgcagga attcgatatc aagcttatcg ataccgtcga c 10071

<210> 2

<211> 1379

<212> PRT

<213> Debaryomyces hansenii

<220>

<223> Cas9

<400> 2

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

1010 1015 1020

Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser

1025 1030 1035 1040

Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu

1045 1050 1055

Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile

1060 1065 1070

Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser

1075 1080 1085

Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly

1090 1095 1100

Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile

1105 1110 1115 1120

Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser

1125 1130 1135

Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly

1140 1145 1150

Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile

1155 1160 1165

Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala

1170 1175 1180

Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys

1185 1190 1195 1200

Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser

1205 1210 1215

Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr

1220 1225 1230

Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1250 1255 1260

Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val

1265 1270 1275 1280

Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys

1285 1290 1295

His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu

1300 1305 1310

Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp

1315 1320 1325

Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp

1330 1335 1340

Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile

1345 1350 1355 1360

Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Ser Arg Ala Asp Pro Lys Lys Lys

1365 1370 1375

Arg Lys Val

<210> 3

<211> 10071

<212> DNA

<213> Debaryomyces hansenii

<220>

<223> /plasmid="pDhCas9sgRNA"

<220>

<221> CDS

<222> 801..4940

<223> /gene="Cas9"

/transl_table=12

<400> 3