Сконструированные нуклеиновые кислоты, нацеленные на нуклеиновую кислоту - RU2018117360A

1. Композиция двух или более сконструированных последовательностей нуклеиновой кислоты, образующих остов (nucleic acid sequences forming a scaffold, «NASC»), причем указанная композиция NASC содержит

первый компонент сконструированной нуклеиновой кислоты («NASC-PC1») содержащий в направлении от 5'- к 3'-концу

спейсерный элемент 1, содержащий последовательность 1, связывающуюся с нуклеиновой кислотой-мишенью,

элемент повтора 1, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты 1 повтора, и

элемент связывания 1 белка, связывающего нуклеиновую кислоту, содержащий последовательность связывания 1 белка, связывающего двухцепочечную нуклеиновую кислоту,

причем указанный спейсерный элемент 1 ковалентным способом присоединен к указанному элементу повтора 1, и указанный элемент повтора 1 ковалентным способом присоединен к указанному элементу связывания 1 белка, связывающего нуклеиновую кислоту;

второй компонент сконструированной нуклеиновой кислоты («NASC-PC2»), содержащий в направлении от 5'- к 3'-концу

спейсерный элемент 2, содержащий последовательность 2, связывающуюся с нуклеиновой кислотой-мишенью,

элемент повтора 2, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты 2 повтора, и

элемент связывания 2 белка, связывающего нуклеиновую кислоту, содержащий последовательность связывания 2 белка, связывающего двухцепочечную нуклеиновую кислоту,

причем указанный спейсерный элемент 2 ковалентным способом присоединен к указанному элементу повтора 2, и указанный элемент повтора 2 ковалентным способом присоединен к указанному элементу связывания 2 белка, связывающего нуклеиновую кислоту;

причем существует соединение между указанной последовательностью нуклеиновой кислоты 1 повтора и указанной последовательностью нуклеиновой кислоты 2 повтора посредством связанных водородной связью пар оснований, причем указанное соединение образует композицию NASC, и указанная композиция NASC способна к связыванию с первым белком, связывающим двухцепочечную нуклеиновую кислоту, и вторым белком, связывающим двухцепочечную нуклеиновую кислоту.

2. Композиция NASC по п. 1, отличающаяся тем, что указанный первый белок, связывающий двухцепочечную нуклеиновую кислоту, представляет собой белок CRISPR-Cas9 Класса 2 Типа II, и указанный второй белок, связывающий двухцепочечную нуклеиновую кислоту, представляет собой белок CRISPR-Cas9 Класса 2 Типа II.

3. Композиция NASC по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанный первый белок, связывающий двухцепочечную нуклеиновую кислоту, и указанный второй белок, связывающий двухцепочечную нуклеиновую кислоту, представляют собой один и тот же белок CRISPR-Cas9 Класса 2 Типа II.

4. Композиция NASC по любому предшествующему пункту, отличающаяся тем, что

указанный спейсерный элемент 1 также содержит последовательность нуклеиновой кислоты линкерного элемента, в направлении 3'-конца относительно последовательности 1, связывающейся с нуклеиновой кислотой-мишенью, и расположенную в направлении 5'-конца от элемента повтора 1; и

указанный спейсерный элемент 2 также содержит последовательность нуклеиновой кислоты линкерного элемента, в направлении 3'-конца относительно последовательности 1, связывающейся с нуклеиновой кислотой-мишенью, и расположенную в направлении 5'-конца от элемента повтора 1.

5. Композиция NASC по п. 4, отличающаяся тем, что

указанный элемент повтора 1 также содержит в направлении от 5'- к 3'-концу последовательность нуклеиновой кислоты 1b повтора, последовательность нуклеиновой кислоты 1 линкерного элемента и последовательность нуклеиновой кислоты 1а повтора; и

указанный элемент повтора 2 также содержит в направлении от 5' - к 3'-концу последовательность нуклеиновой кислоты 1аС повтора, последовательность нуклеиновой кислоты 2 линкерного элемента и последовательность нуклеиновой кислоты 1bС повтора, последовательность нуклеиновой кислоты 1 повтора и последовательность нуклеиновой кислоты линкерного элемента;

причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1b повтора и указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1bС повтора соединены посредством связанных водородной связью пар оснований, и указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1а повтора и указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1аС повтора соединены посредством связанных водородной связью пар оснований.

6. Композиция NASC по п. 5, отличающаяся тем, что

указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1b повтора также содержит в направлении от 5'- к 3'-концу

последовательность нуклеиновой кислоты 1b2 повтора,

последовательность нуклеиновой кислоты 1b1 выпячивания и

последовательность нуклеиновой кислоты 1b1 повтора;

указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1а повтора также содержит в направлении от 5'- к 3'-концу

последовательность нуклеиновой кислоты 1а2 повтора,

последовательность нуклеиновой кислоты 1a1 выпячивания и

последовательность нуклеиновой кислоты 1a1 повтора;

указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1аС повтора также содержит в направлении от 5'- к 3'-концу

последовательность нуклеиновой кислоты 1a1С повтора,

последовательность нуклеиновой кислоты 2а2 выпячивания и

последовательность нуклеиновой кислоты 1а2С повтора; и

указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1bС повтора также содержит в направлении от 5'- к 3'-концу

последовательность нуклеиновой кислоты 1b1С повтора,

последовательность нуклеиновой кислоты 2b2 выпячивания и

последовательность нуклеиновой кислоты 1b2С повтора;

причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1a1 повтора и указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1a1С повтора соединены посредством связанных водородной связью пар оснований, указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1а2 повтора и указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1а2С повтора соединены посредством связанных водородной связью пар оснований, указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1b1 повтора и указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1b1С повтора соединены посредством связанных водородной связью пар оснований, и указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1b2 повтора и указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1b2С повтора соединены посредством связанных водородной связью пар оснований.

7. Композиция NASC по п. 6, отличающаяся тем, что

указанная последовательность нуклеиновой кислоты линкерного элемента 1 также содержит в направлении от 5'- к 3'-концу:

последовательность нуклеиновой кислоты 1-2-2 линкерного элемента,

последовательность нуклеиновой кислоты 1-2а повтора и

последовательность нуклеиновой кислоты 1-2-1 линкерного элемента;

указанная последовательность нуклеиновой кислоты 2-2 линкерного элемента также содержит в направлении от 5'- к 3'-концу:

последовательность нуклеиновой кислоты 2-2-1 линкерного элемента

последовательность нуклеиновой кислоты 1-2аС повтора и

последовательность нуклеиновой кислоты 2-2-2 линкерного элемента; причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1-2а повтора и указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1-2аС повтора соединены посредством связанных водородной связью пар оснований и образуют область двухцепочечной нуклеиновой кислоты 1-2.

8. Композиция NASC по п. 7, отличающаяся тем, что

указанная область двухцепочечной нуклеиновой кислоты 1-2 дополнительно содержит сайт связывания эффекторного белка;

указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1-2а повтора дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты 1-2а сайта связывания эффекторного белка; и

указанная последовательность нуклеиновой кислоты 2 повтора дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты 1-2аС сайта связывания эффекторного белка;

причем указанный сайт связывания эффектора образован посредством образования водородных связей пар оснований между последовательностью нуклеиновой кислоты 1-2а сайта связывания эффекторного белка и последовательностью нуклеиновой кислоты 1-2аС сайта связывания эффекторного белка.

9. Композиция NASC по п. 8, отличающаяся тем, что указанный сайт связывания 1 эффекторного белка представляет собой сайт связывания белка Csy4.

10. Композиция NASC по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что

указанная последовательность нуклеиновой кислоты 1 повтора дополнительно содержит аффинную метку 1; и

указанная последовательность нуклеиновой кислоты 2 повтора дополнительно содержит аффинную метку 2;

причем указанная аффинная метка 1 соединена с указанной аффинной меткой 2.

11. Композиция NASC по п. 10, отличающаяся тем, что указанная композиция NASC содержит РНК, ДНК или РНК и ДНК.

12. Композиция NASC по п. 11, отличающаяся тем, что указанный NASC-PC2 содержит РНК и ДНК.

13. Композиция нуклеиновой кислоты/белка, содержащая

композицию NASC по любому предшествующему пункту; и

первый белок Cas9 и второй белок Cas9.

14. Композиция нуклеиновой кислоты/белка по п. 13, отличающаяся тем, что указанный первый белок Cas9 является таким же, как и указанный второй белок Cas9, и указанный первый белок Cas9 и указанный второй белок Cas9 выбраны из группы, состоящей из белка Cas9 Streptococcus pyogenes, белка Cas9 Streptococcus thermophilus, белка Cas9 Staphylococcus aureus и белка Cas9 Campylobacter jejuni.

15. Композиция нуклеиновой кислоты/белка по п. 13, отличающаяся тем, что указанный первый белок Cas9 отличается от указанного второго белка Cas9, и указанный первый белок Cas9 и указанный второй белок Cas9 выбраны из группы, состоящей из белка Cas9 Streptococcus pyogenes, белка Cas9 Streptococcus thermophilus, белка Cas9 Staphylococcus aureus и белка Cas9 Campylobacter jejuni.

16. Композиция нуклеиновой кислоты/белка по п. 15, отличающаяся тем, что указанный первый белок Cas9 и указанный второй белок Cas9 выбраны из группы, состоящей из белка Саs9/белка Cas9, белка Саs9/белка dCas9, белка dСаs9/белка Cas9 и белка dCas9/бнлеп dCas9, соответственно.

17. Композиция нуклеиновой кислоты/белка по любому из пп. 13-16, отличающаяся тем, что указанная композиция NASC содержит РНК, ДНК или РНК и ДНК.

18. Набор, содержащий

композицию NASC по любому из пп. 1-12 или одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих композицию NASC по любому из пп. 1-12; и

буфер.

19. Набор по п. 18, дополнительно содержащий один или несколько белков Cas9 или одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих один или несколько белков Cas9.

20. Набор по п. 18, дополнительно содержащий нуклеопротеиновые комплексы, которые содержат композицию NASC и один или несколько белков Cas9.