Способ определения мутантного гена посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием днк-полимеразы с ингибированной 5'-флэп-эндонуклеазной активностью - RU2016126512A
Код документа: RU2016126512A
Формула
1. Способ определения мутантного гена посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, содержащий ингибирование или устранение 5'-флэп-эндонуклеазной активности ДНК-полимераз, обладающих 5'-флэп-эндонуклеазной активностью.
2. Способ определения мутантного гена посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по п. 1, отличающийся тем, что ДНК-полимераза является термостабильной ДНК-полимеразой.
3. Способ определения мутантного гена посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по п. 1, отличающийся тем, что ингибирование или устранение 5'-флэп-эндонуклеазной активности осуществляют посредством по меньшей мере одного процесса, выбранного из следующих процессов:
a) регулирование условий ферментативной реакции;
b) использование рекомбинантной ДНК-полимеразы, 5'-флэп-эндонуклеазная активность которой ингибирована или устранена;
c) добавление ингибиторов 5'-флэп-эндонуклеазной активности; и
d) регулирование расположения по меньшей мере одного участка связывания праймера и зонда относительно ДНК-полимеразы.
4. Способ определения мутантного гена посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по п. 3, отличающийся тем, что в процессе d) 5'-флэп-эндонуклеазная активность ДНК-полимеразы ингибируют путем расположения 5'-флэп-эндонуклеазы в специфическом месте таким образом, что 5'-конец прямого праймера для амплификации и 5'-конец зонда для детектирования находятся в пределах 24-38 оснований от ДНК-полимеразы.
5. Способ определения мутантного гена посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по п. 3, отличающийся тем, что зонд имеет 5'-концевой флэп-участок.
6. Способ определения мутантного гена посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по п. 3, отличающийся тем, что 5'-конец зонда имеет непрерывную флэп-структуру или прерывистую флэп-структуру из одного или нескольких оснований.
7. Способ определения мутантного гена посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по п. 1, отличающийся тем, что мутантный ген содержит по меньшей мере один элемент, выбранный из однонуклеотидного полиморфизма (SNP), делеции, замещения и инсерции одного или нескольких оснований.
8. Способ определения мутантного гена посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием ДНК-полимераз, обладающих 5'-флэп-эндонуклеазной активностью, в котором определение мутантного гена осуществляют с использованием зонда, способного ингибировать 5'-флэп-эндонуклеазную активность ДНК-полимеразы.
9. Способ определения мутантного гена посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием ДНК-полимераз, обладающих 5'-флэп-эндонуклеазной активностью, по п. 8, отличающийся тем, что зонд содержит сайт генетической мутации, расположенный на 5'-конце зонда.
10. Способ определения мутантного гена посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием ДНК-полимераз, обладающих 5'-флэп-эндонуклеазной активностью, по п. 8, отличающийся тем, что мутантный ген содержит по меньшей мере один элемент, выбранный из однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), делеции, замещения и инсерции одного или нескольких оснований.
11. Способ определения мутантного гена посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием ДНК-полимераз, обладающих 5'-флэп-эндонуклеазной активностью, по п. 8, отличающийся тем, что зонд имеет 5'-концевую флэп-структуру, индуцируемую в зависимости от аллелей и ингибирующую 5'-флэп-эндонуклеазную активность ДНК-полимеразы.
12. Способ определения мутантного гена посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием ДНК-полимераз, обладающих 5'-флэп-эндонуклеазной активностью, по п. 11, отличающийся тем, что зонд, имеющий индуцируемую 5'-концевую флэп-структуру, способную ингибировать 5'-флэп-эндонуклеазную активность ДНК-полимеразы, содержит структуру, в которой 5'-флэп имеет одно основание, структуру, в которой 5'-флэп имеет два основания, или прерывистую активируемую структуру, в которой 5'-флэп имеет два основания, а одно концевое основание является сочетаемым (Mis+3(1)).
13. Способ определения мутантного гена посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием ДНК-полимеразы, обладающей 5'-флэп-эндонуклеазной активностью, по п. 10, отличающийся тем, что мутантный ген, содержащий по меньшей мере один элемент, выбранный из делеции, замещения и инсерции одного или нескольких оснований, расположен у 5'-конца зонда, способного ингибировать FEN-активность ДНК-полимеразы.
14. Набор для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для определения мутантного гена, содержащий матричную ДНК, двухцепочечный прямой праймер, двухцепочечный обратный праймер, зонд и термостабильную ДНК-полимеразу, при этом зонд ингибирует FEN-активность ДНК-полимеразы.
15. Набор для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по п. 14, отличающийся тем, что зонд представляет собой зонд с двумя метками, модифицированный одновременно красителем-репортером и красителем-гасителем, или немодифицированный зонд.
16. Набор для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по п. 14, отличающийся тем, что каждый из двухцепочечного прямого праймера и двухцепочечного обратного праймера содержит комплементарно связывающуюся последовательность, а зонд является зондом с двумя метками, модифицированным одновременно красителем-репортером и красителем-гасителем.
17. Набор для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по п. 15, отличающийся тем, что, при использовании немодифицированных зондов, добавлен связывающийся с поверхностью агент или интеркалирующий агент, способный присоединяться к двойным связям ДНК.
