Варианты рнк-полимеразы т7 - RU2020103727A
Код документа: RU2020103727A
Формула
1. Сконструированная РНК-полимераза, где указанная полимераза использует кэп или аналог кэпа в ходе инициации транскрипции.
2. Сконструированная РНК-полимераза по п.1, где указанная РНК-полимераза предпочтительно использует кэп или аналог кэпа в ходе инициации транскрипции.
3. Сконструированная РНК-полимераза по п.1 или 2, где указанная РНК-полимераза не использует кэп или аналог кэпа в ходе элонгации транскрипции.
4. Сконструированная РНК-полимераза по любому из п.п.1-3, где указанная сконструированная РНК-полимераза представляет собой сконструированную РНК-полимеразу T7.
5. Сконструированная РНК-полимераза по п.4, где указанная сконструированная РНК-полимераза T7 содержит по меньшей мере одну замену относительно SEQ ID NO: 4 и/или 15.
6. Сконструированная РНК-полимераза, содержащая полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4 и/или 15, или ее функциональный фрагмент, где указанная сконструированная РНК-полимераза содержит по меньшей мере одну замену или группу замен в указанной полипептидной последовательности, и где положения аминокислот указанной полипептидной последовательности пронумерованы относительно SEQ ID NO: 4 или 15.
7. Сконструированная РНК-полимераза по п.6, где по меньшей мере одна замена или группа замен выбрана из 397/513/635, 397/513/635/660, 513/660/664, 513/635/660, 513/635/664, 513/660/664 и 660/664, и/или любых их комбинаций, где положения аминокислот пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO: 4.
8. Сконструированная РНК-полимераза по п.6, где по меньшей мере одна замена или группа замен выбрана из 397, 397/513, 397/513/635, 397/513/635, 397/513/635/656, 397/513/635/656/660, 397/513/635/656/660/664, 397/513/635/656/664, 397/513/635/660, 397/513/635/660/664, 397/513/635/664, 397/513/656/660, 397/513/660, 397/513/660/664, 397/513/664, 397/513, 397/635, 397/635/656/660/664, 397/635/656/664, 397/635/660, 397/635/664, 397/635/664/850, 397/660, 397/664 и/или любых их комбинаций, где положения аминокислот пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO: 4.
9. Сконструированная РНК-полимераза по п.6, где по меньшей мере одна замена или группа замен выбрана из 113/137/513, 136/357/404/514, 136/357/514, 136/394/404/446, 136/401, 136/401/404, 136/404/446, 136/404/514, 136/446, 136/514, 137, 137/401, 137/401/513, 137/401/513, 137/513, 137/513/621, 137/635, 137/656, 357/394/401/404/514, 357/394/446/514, 357/514, 394/446/514, 401/404, 401/404/514, 401/513/635, 401/635, 513/635, 513/635/656, 513/660, 635/656, 635/660 и 660, и/или любых их комбинаций, где положения аминокислот пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO: 15.
10. Сконструированная РНК-полимераза по п.6, где указанная сконструированная РНК-полимераза содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична последовательности по меньшей мере одного варианта сконструированной РНК-полимеразы, указанного в таблице 5.3, 5.4, 5.5 и/или 5.6.
11. Сконструированная РНК-полимераза по п.6, где указанная сконструированная РНК-полимераза включает вариант сконструированной полимеразы, приведенный в таблице 5.3, 5.4, 5.5 и/или 5.6.
12. Сконструированная РНК-полимераза по п.6, где указанная сконструированная РНК-полимераза содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична последовательности по меньшей мере одного сконструированного варианта РНК-полимеразы, указанного в SEQ ID NO: 4, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 и/или 39.
13. Сконструированная РНК-полимераза по п.6, где указанная сконструированная РНК-полимераза содержит вариант сконструированной полимеразы, указанный в SEQ ID NO: 4, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 или 39.
14. Сконструированная РНК-полимераза по любому из пп.1-13, где указанная сконструированная полимераза демонстрирует по меньшей мере одно улучшенное свойство по сравнению с РНК-полимеразой T7 дикого типа.
15. Сконструированная РНК-полимераза по п.14, где указанное по меньшей мере одно улучшенное свойство выбрано из увеличенной селективности в отношении аналога кэпа относительно GTP в ходе инициации трансляции, увеличенной экспрессии белка, увеличенной стабильности в буфере для хранения и увеличенной стабильности в условиях реакции.
16. Сконструированная РНК-полимераза по любому из пп.1-15, где полимераза сохраняет выход РНК, точность транскрипции, термостабильность, экспрессию белка, стабильность при -20°C или стабильность в условиях реакции, эквивалентные РНК-полимеразе T7 дикого типа.
17. Сконструированная РНК-полимераза по любому из пп.1-16, где указанная РНК-полимераза образует более чем приблизительно 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более кэпированных РНК-транскриптов относительно некэпированных транскриптов.
18. Сконструированная РНК-полимераза по п.17, где указанная РНК-полимераза образует более 90% кэпированных РНК-транскриптов относительно некэпированных транскриптов.
19. Сконструированная РНК-полимераза по любому из пп.1-18, где указанная сконструированная полимераза является очищенной.
20. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере одну сконструированную РНК-полимеразу по любому из пп.1-19.
21. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере одну сконструированную РНК-полимеразу, обладающую по меньшей мере 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4 и/или 15, или ее функциональный фрагмент, где указанная сконструированная РНК-полимераза содержит по меньшей мере одну замену в одном или более положениях аминокислот.
22. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере одну сконструированную РНК-полимеразу, обладающую по меньшей мере 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 и/или 39, или ее функциональный фрагмент.
23. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере одну сконструированную РНК-полимеразу, где указанные полинуклеотидные последовательности обладают по меньшей мере 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 и/или 38.
24. Полинуклеотидная последовательность по любому из пп.20-23, где указанная полинуклеотидная последовательность функционально связана с контрольной последовательностью.
25. Полинуклеотидная последовательность по любому из пп.20-24, где указанная полинуклеотидная последовательность является кодон-оптимизированной.
26. Экспрессирующий вектор, содержащий по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность по любому из пп.20-25.
27. Клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере один экспрессирующий вектор по п.26.
28. Способ продуцирования сконструированной РНК-полимеразы в клетке-хозяине, включающий культивирование клетки-хозяина по п.27 в подходящих условиях культивирования, так чтобы продуцировалась по меньшей мере одна сконструированная РНК-полимераза.
29. Способ по п.28, дополнительно включающий выделение по меньшей мере одной сконструированной РНК-полимеразы из культуры и/или клетки-хозяина.
30. Способ по п.28 и/или 29, дополнительно включающий стадию очистки указанной по меньшей мере одной сконструированной РНК-полимеразы.
31. Композиция, содержащая по меньшей мере одну сконструированную РНК-полимеразу по любому из пп.1-19.
32. Способ получения в значительной степени кэпированной мРНК, включающий проведение реакции транскрипции in vitro с использованием сконструированной РНК-полимеразы.
33. Способ по п.32, где указанная сконструированная РНК-полимераза образует более чем приблизительно 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более кэпированных РНК-транскриптов относительно некэпированных транскриптов.
34. Способ по п.33, где указанная сконструированная РНК-полимераза образует более 90% или более кэпированных РНК-транскриптов относительно некэпированных транскриптов.
35. Способ по п.34, где указанная сконструированная РНК-полимераза образует более 95% или более кэпированных РНК-транскриптов относительно некэпированных транскриптов.
36. Способ продуцирования кэпированных РНК-транскриптов, включающий предоставление композиции, содержащей: i) по меньшей мере одну сконструированную РНК-полимеразу по любому из пп.1-19, динуклеотидный аналог кэпа, и ii) ДНК-матрицу; воздействие на указанную ДНК-матрицу указанной композицией в условиях, чтобы указанная сконструированная РНК-полимераза продуцировала кэпированный РНК-транскрипт.
37. Способ по п.36, где динуклеотидный аналог кэпа представляет собой альфа, гамма-бис(N7-метилгуанозин)трифосфат (m7G(5’)ppp(5’)m7G) или антиреверсный аналог кэпа 3’-O-Me-m7G(5')ppp(5')G.
38. Способ по п.36 и/или 37, где динуклеотидный аналог кэпа представляет собой альфа, гамма-бис(N7-метилгуанозин)трифосфат.
39. Способ по любому из пп.36-38, где указанная сконструированная РНК-полимераза образует более чем приблизительно 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более кэпированных РНК-транскриптов относительно некэпированных транскриптов.
40. Способ по п.39, где указанная сконструированная РНК-полимераза образует более 90% или более кэпированных РНК-транскриптов относительно некэпированных транскриптов.
41. Способ по п.40, где указанная сконструированная РНК-полимераза образует более 95% или более кэпированных РНК транкриптов относительно некэпированных транскриптов.
42. Способ по любому из пп.36-41, где указанный способ включает реакцию транскрипции in vitro.
43. Способ по любому из п.п.32-42, дополнительно включающий добавление неорганической пирофосфатазы.
