Способ получения рекомбинантной сахарозосинтазы, ее применение в приготовлении наборов для определения сахарозы, получении adp-глюкозы и получении трансгенных растений, листья и запасающие органы которых накапливают высокие содержания adp-глюкозы и крахма - RU2006131670A

Реферат

1. Способ эффективного получения высоких уровней рекомбинантного фермента сахарозосинтазы (SS) в его растворимой, активной форме, отличающийся тем, что он предусматривает

а) получение из нуклеотидной последовательности гена, который кодирует изоформу SS картофеля SS4, 2 праймеров, представленных SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, с которыми, на основе кДНК-библиотеки листа картофеля, амплифицируют при помощи ПЦР кДНК-фрагмент из 2418 п.н., представленный SEQ ID NO:3,

b) встраивание указанного кДНК-фрагмента в первый вектор,

с) встраивание указанного первого вектора в первый микроорганизм-хозяин, где он амплифицируется,

d) расщепление амплифицированной конструкции, по меньшей мере, двумя рестрикционными ферментами,

е) получение, после предшествующего расщепления, ДНК-фрагмента, содержащего кДНК, которая кодирует SSX, расшифрованная аминокислотная последовательность которого представлена SEQ ID NO:4,

f) клонирование указанного фрагмента в тех же самых сайтах рестрикции в виде вектора, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую богатую гистидином последовательность, слияние указанного богатого гистидином хвоста с SS, с получением второго экспрессирующего вектора,

g) встраивание этого второго вектора во второй микроорганизм-хозяин, где он экспрессируется,

h) инкубирование указанного трансформированного микроорганизма в подходящих условиях культивирования для синтеза SSX в его растворимой, активной форме,

i) выделение и очистка SSX в его активной форме.

2. Способ получения рекомбинантной SS по предыдущему пункту, отличающийся тем, что первым экспрессирующим вектором, используемым на стадии b), является плазмида pSK, которая при встраивании в SEQ ID NO:3 образует конструкцию pSS фиг. 3А.

3. Способ получения рекомбинантной SS по предыдущему пункту, отличающийся тем, что первым микроорганизмом-хозяином, используемым на стадии с) для амплификации плазмиды pSK, является бактерия E. coli XL1 Blue.

4. Способ получения рекомбинантной SS по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что рестрикционными ферментами, используемыми на стадии d), являются NcoI и NotI.

5. Способ получения рекомбинантной SS по п.1, отличающийся тем, что на стадии f) сайты рестрикции, в которые клонируют ДНК-фрагмент, высвобождаемый после стадии d), являются теми же самыми, что и в плазмиде pET-28a(+), показанной на фиг.3В, что приводит к образованию плазмиды pET-SS, показанной на фиг.3С.

6. Способ получения рекомбинантной SS по п.1, отличающийся тем, что вторым микроорганизмом-хозяином, используемым на стадии g), является штамм BLR(DE3) Escherichia coli.

7. Способ получения рекомбинантной SS по п.1, отличающийся тем, что штаммом, трансформированным на стадии g), который инкубируют на стадии h) в подходящих условиях культивирования для синтеза SSX в его растворимой и активной форме, является СЕСТ 5850.

8. Способ получения рекомбинантной SS по п.1, отличающийся тем, что подходящие условия культивирования для синтеза SSX предусматривают обеспечение бактериальной культуре температуры 20^оС.

9. Способ получения рекомбинантной SS по п.1, отличающийся тем, что очистку SSX предпочтительно выполняют аффинной хроматографией для аминокислотных последовательностей, богатых остатками гистидина, с буфером для элюции, который содержит имидазол, предпочтительно в концентрации 200 мМ.

10. Способ получения рекомбинантной SS по п.1, отличающийся тем, что для поддержания очищенного фермента SSX в его активной форме указанный очищенный фермент, элюированный из аффинной хроматографии, немедленно подвергают диализу для удаления любых следов имидазола.

11. Способ получения рекомбинантной изоформы SS5 картофеля, отличающийся тем, что он предусматривает:

а) использование конструкции pSS в качестве матрицы и, направленным мутагенезом после последовательного применения пар праймеров, последовательностями которых являются [SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6], [SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8] и [SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10], получение ДНК-фрагмента из 2418 п.н., представленного SEQ ID NO:11,

b) встраивание указанного ДНК-фрагмента в первый вектор,

с) встраивание указанного первого вектора в первый микроорганизм-хозяин, где он амплифицируется,

d) расщепление амплифицированной конструкции, по меньшей мере, двумя рестрикционными ферментами,

е) получение, после предшествующего расщепления, ДНК-фрагмента, который кодирует SS5, аминокислотная последовательность которой представлена SEQ ID NO:12,

f) клонирование указанного фрагмента в тех же самых сайтах рестрикции в виде вектора, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую His-богатую последовательность, слияние указанного His-богатого хвоста с SS5, с получением второго экспрессирующего вектора,

g) встраивание этого второго вектора во второй микроорганизм-хозяин, где он экспрессируется,

h) инкубирование указанного трансформированного микроорганизма в подходящих условиях культивирования для синтеза SS5 в ее растворимой, активной форме,

i) выделение и очистка SS5 в ее активной форме.

12. Способ получения рекомбинантной SS5 по п.11, отличающийся тем, что на стадии b) образуется конструкция pSS5.

13. Способ получения рекомбинантной SS5 по любому из п.11 или 12, отличающийся тем, что первым микроорганизмом-хозяином, используемым на стадии с) для амплификации pSS5, является бактерия E. coli XL1 Blue.

14. Способ получения рекомбинантной SS5 по п.11, отличающийся тем, что рестрикционными ферментами, используемыми на стадии d), являются NcoI и NotI.

15. Способ получения рекомбинантной SS5 по п.11, отличающийся тем, что на стадии f) сайты рестрикции, в которые клонируют ДНК-фрагмент, высвобождаемый после стадии d), являются теми же самыми, что и в плазмиде pET-28a(+), что приводит к образованию плазмиды pET-SS5.

16. Способ получения рекомбинантной SS5 по п.11, отличающийся тем, что вторым микроорганизмом-хозяином, используемым на стадии g), является штамм BLR(DE3) Escherichia coli.

17. Способ получения рекомбинантной SS5 по п.11, отличающийся тем, что штаммом, трансформированным на стадии g), который инкубируют на стадии h) в подходящих условиях культивирования для синтеза SS5 в ее растворимой и активной форме, является СЕСТ 5849.

18. Способ получения рекомбинантной SS5 по п.11, отличающийся тем, что подходящие условия культивирования для синтеза SS5 предусматривают обеспечение бактериальной культуре температуры 20^оС.

19. Способ получения рекомбинантной SS5 по п.11, отличающийся тем, что очистку SS5 предпочтительно выполняют аффинной хроматографией с буфером для элюции, который содержит имидазол, предпочтительно в концентрации 200 мМ.

20. Способ получения рекомбинантной SS5 по п.11, отличающийся тем, что для поддержания очищенного фермента SS5 в его активной форме указанный очищенный фермент, элюированный из аффинной хроматографии, немедленно подвергают диализу для удаления любых следов имидазола.

21. Растворимый, активный рекомбинантный продукт-фермент SSX, получаемый способом по пп.1-10, отличающийся тем, что он имеет расшифрованную последовательность, представленную SEQ ID NO:4, и проявляет сахарозосинтазную (SS) активность.

22. Растворимый, активный рекомбинантный продукт-фермент SSX, по п.21, отличающийся тем, что он имеет удельную активность 80 Е/мг белка в присутствии сахарозы и UDP и кинетические параметры Km(UDP) = 0,25 мМ и Km(сахароза) = 30 мМ.

23. Изоформа SS5 растворимого, активного рекомбинантого продукта-фермента по п.21 и 22, получаемая в способе по п.п.11-20, отличающаяся тем, что она имеет расшифрованную аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:12, и проявляет сахарозосинтазную (SS) активность.

24. Рекомбинантная изоформа SS5 по п.23, отличающаяся тем, что она имеет удельную активность 80 Е/мг белка и 60 Е/мг белка в присутствии UDP и ADP, соответственно, и кинетические параметры в отношении UDP и ADP Km(UDP) = Km(ADP) 0,3 мМ.

25. Применение продукта-фермента по пп.21 и 22 в получении UDPG, отличающееся инкубированием UDP и SSX в подходящих условиях с последующими выделением и очисткой полученной UDPG.

26. Применение по п.25, отличающееся тем, что оно предусматривает:

а) инкубирование 100 мл следующего раствора в течение 12 ч при 37^оС:

b) остановку реакции нагреванием, предпочтительно при 100^оС в течение 90 с,

с) центрифугирование при 10000 g в течение 10 мин,

d) хроматографирование супернатанта при помощи ВЭЖХ, элюцию и очистку UDPG общепринятыми способами.

27. Применение продукта-фермента по пп.23 и 24 в получении ADPG, отличающееся инкубированием ADP и SS5 в подходящих условиях с последующими выделением и очисткой полученной ADPG.

28. Применение по п.27, отличающееся тем, что оно предусматривает

е) инкубирование 100 мл следующего раствора в течение 12 часов при 37^оС:

f) остановку реакции нагреванием, предпочтительно при 100^оС в течение 90 с,

g) центрифугирование при 10000 g в течение 10 мин,

h) хроматографирование супернатанта при помощи ВЭЖХ, элюцию и очистку ADPG общепринятыми способами.

29. Применение продукта-фермента с сахарозосинтазной (SS) активностью в приготовлении наборов для анализов для спектрофотометрического/флуорометрического/амперометрического определения сахарозы.

30. Применение по п.29, отличающееся тем, что оно предусматривает следующую инкубационную среду:

а. 2 единицы SS,

b. 2 мМ ADP,

с. 2 единицы ADPG-пирофосфатазы растительного, животного или микробного происхождения,

d. 2 единицы PGM,

е. 2 единицы G6PDH,

f. 0,5 мМ NAD(P),

g. 100 мл реакционного буфера: 50 мМ HEPES, рН 7,0/1 мм ЭДТА/20% полиэтиленгликоль/1 мМ MgCl₂/15 мМ KCl,

h. предварительно отфильтрованная тест-проба.

31. Применение по п.29, отличающееся тем, что оно предусматривает следующую инкубационную среду:

а. 2 единицы SS,

b. 2 мМ UDP,

с. 2 единицы UDPG-пирофосфатазы растительного, животного или микробного происхождения,

d. 2 единицы PGM,

е. 2 единицы G6PDH,

f. 0,5 мМ NAD(P),

g. 100 мл реакционного буфера: 50 мМ HEPES, рН 7,0/1 мм ЭДТА/20% полиэтиленгликоль/1 мМ MgCl₂/15 мМ KCl,

h. предварительно отфильтрованная тест-проба.

32. Применение по п.29, отличающееся тем, что оно предусматривает следующую инкубационную среду:

а. 2 единицы SS,

b. 2 мМ UDP,

с. 2 единицы UDPG-дегидрогеназы,

d. 0,5 мМ NAD,

е. 100 мл реакционного буфера: 50 мМ HEPES, рН 7,0/1 мм ЭДТА/20% полиэтиленгликоль/1 мМ MgCl₂ /15 мМ KCl,

f. предварительно отфильтрованная тест-проба.

33. Применение по любому из пп.29-32, отличающееся тем,что SS, присутствующая в наборе для анализа, является, без предпочтений, SS4, SS5 или SSX или их комбинацией.

34. Применение ДНК, которая кодирует SS, в получении трансгенных растений, которые экспрессируют SS, отличающееся встраиванием генетической конструкции, которая содержит и экспрессирует указанную ДНК, в подходящий вектор и перенос указанной генетической конструкции в геном растения.

35. Применение по п.34, отличающееся тем, что используемая кДНК кодирует SSX.

36. Применение по п.35, отличающееся тем, что оно предусматривает следующие стадии:

а) последовательное встраивание, в плазмиду pSS, промотора 35S и терминатора NOS в 5'- и 3'-районы соответственно гена SSX или любой другой версии, которая кодирует SS, для получения плазмиды p35S-SS-NOS, рестрикционная карта которой показана на фиг. 4В,

b) последовательное расщепление p35S-SS-NOS ферментами NotI, ДНК-полимераза Т4 и HindIII,

с) клонирование полученного фрагмента, в бинарной плазмиде pBIN20, предварительно расщепленной последовательно EcoRI, ДНК-полимеразой Т4 и HindIII, с получением плазмиды pBIN35S-NOS, показанной на фиг. 4С,

d) амплификацию pBIN35S-NOS в E. coli (XL1 Blue),

е) встраивание генетической конструкции, амплифицированной на предыдущей стадии, в Agrobacterium tumefaciens С58:GV2260 с получением трансформированного штамма СЕСТ 5851,

f) трансфекцию растений трансформированным штаммом СЕСТ 5851.

37. Применение по п.35, отличающееся тем, что оно предусматривает следующие стадии:

а) последовательное встраивание, в плазмиду pGEMT, промотора гена, который кодирует малую субъединицу RUBISCO, для получения плазмиды pGEMT-RBCSprom, рестрикционная карта которой показана на фиг.5А,

b) расщепление pGEMT-RBCS ферментами HindIII и NcoI для встраивания фрагмента, высвобожденного в соответствующих сайтах рестрикции p35S-SS-NOS, с получением pRBCS-SS-NOS, рестрикционная карта которой показана на фиг.5В,

с) последовательное расщепление pRBCS-SS-NOS ферментами HindIII, ДНК-полимеразой Т4 и NotI и клонирование фрагмента, высвобожденного в pBIN20, расщепленной последовательно ферментами HindIII, ДНК-полимеразой Т4 и EcoRI, с получением pBINRBCS-SS-NOS, рестрикционная карта которой показана на фиг.5С,

d) амплификацию pBINRBCS-SS-NOS в E. coli (XL1 Blue),

е) встраивание генетической конструкции, амплифицированной на предыдущей стадии, в Agrobacterium tumefaciens С58:GV2260 и трансфекцию растений этим трансформированным штаммом.

38. Трансгенные растения, получаемые способом применения по п.п.33-37, отличающиеся сверхэкспрессией активности фермента SS.

39. Трансгенные растения по п.38, отличающиеся тем, что указанная сверхэкспрессия предполагает уровни активности фермента SS примерно в 2-10 раз более высокого, чем уровни, присутствующие в той же самой ткани нетрансгенного растения дикого типа.

40. Трансгенные растения по п.38 или 39, отличающиесятем, чтоони предпочтительно выбраны из растений табака, картофеля, томата или риса.

41. Трансгенные растения по любому из п.38 или 39, отличающиеся тем, что они, кроме того, имеют более высокие содержания сахарозы, G6P, ADPG и крахмала, чем содержания, наблюдаемые в той же самой ткани или в том же самом органе соответствующих растений дикого типа, росших в идентичных условиях.

42. Трансгенные растения по п.40, листья которых имеют содержание сахарозы, G6P, ADPG и крахмала и отношение амилоза/амилопектин, более высокие, чем содержание сахарозы, G6P, ADPG и крахмала и отношение амилоза/амилопектин, наблюдаемые в листьях соответствующих растений дикого типа.

43. Трансгенные растения по п.40, корни, клубни и/или семена которых имеют содержание сахарозы, G6P, ADPG и крахмала и отношение амилоза/амилопектин, более высокие, чем содержание сахарозы, G6P, ADPG и крахмала и отношение амилоза/амилопектин, наблюдаемые в тех же самых тканях и органах соответствующих растений дикого типа.