Способ избирательного получения растений с мужской или женской стерильностью - RU2004129286A

Реферат

1. Способ получения растений с мужской или женской стерильностью, включающий следующие этапы: трансформации растительного материала полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере один фермент, который взаимодействует с нефитотоксичной субстанцией с образованием фитотоксичной субстанции, и регенерации из трансформированного таким образом материала растения, где нефитотоксичную субстанцию наносят на растение до образования и/или созревания мужской или женской гамет, при этом происходит образование из нефитотоксичной субстанции фитотоксичной субстанции, которая избирательно предотвращает формирование или в другом варианте нарушает функцию гамет, при этом фермент экспрессируется предпочтительно в структурах либо мужской, либо женской репродуктивной системы, отличающийся тем, что (I) нефитотоксичную субстанцию выбирают из группы, включающей сложноэфирные производные не относящихся к фосфонатам гербицидов, которые обладают непосредственной фитотоксичностью в отношении незеленой ткани, D-альфа-аминокислоты, пептидные производные не входящих в состав протеинов D-альфа-аминокислот, S-энантиомеры арилоксифеноксипропионатов и S-энантиомеры сложноэфирных производных арилоксифеноксипропионатов, и (II) фермент выбирают из группы, включающей карбоксилэстеразы, оксидазы D-аминокислот, дегидрогеназы D-аминокислот, рацемазы D-аминокислот, 2-арилпропионил-СоА-эпимеразы, альфа-матилацил-СоА-рацемазы, тиоэстеразы и ацил-СоА-синтетазы.

2. Способ по п.1, в котором указанную нефитотоксичную субстанцию наносят в смеси с по меньшей мере еще одной субстанцией, выбранной из группы, включающей антидоты, гаметоциды, индукторы глутатион-S-трансферазы, индукторы цитохрома Р450, гербициды, удобрения, нематоциды, синергисты, инсектициды, фунгициды, гормоны, регуляторы роста растений и ингибиторы цитохрома Р450.

3. Способ по п.1, в котором нефитотоксичную субстанцию наносят на листья, и она представляет собой обладающий способностью продвигаться по флоэме и метаболически стабильный окисляемый субстрат фермента, при этом фермент непосредственно или косвенно обеспечивает образование фитотоксичного продукта из нефитотоксичной субстанции.

4. Способ по п.3, в котором фитотоксичный продукт образуется опосредовано в форме аниона пероксида и/или супероксида.

5. Способ по п.4, в котором нефитотоксичная субстанция представляет собой D-альфа-аминокислоту, выбранную из группы, включающей D-аланин, D-валин, D-метионин, D-серин, D-лейцин и D-изолейцин, и фермент представляет собой оксидазу D-аминокислот или оксидоредуктазу, которая окисляет аминокислоту до 2-кетокислоты, что сопровождается восстановлением кислорода до аниона пероксида.

6. Способ по п.3, в котором нефитотоксичная субстанция представляет собой D-аспартат или D-глутамат, и фермент представляет собой оксидазу D-аминокислот или оксидоредуктазу, которая окисляет аминокислоту до 2-кетокислоты, что сопровождается восстановлением кислорода до аниона пероксида.

7. Способ по п.6, в котором фермент представляет собой мутантную оксидазу D-аминокислот, получаемую из Rhodotorula gracilis, которая несет замены в положениях 213 и/или 238 по сравнению с последовательностью дикого типа, или D-аспартатоксидазу.

8. Способ по п.7, в котором оксидаза, получаемая из Rhodotorula, несет в положении 213 аминокислоту, выбранную из группы, включающей Arg, Lys, Ser, Cys, Asn и Ala, и/или в положении 238 аминокислоту, выбранную из группы, включающей His, Ser, Cys, Asn и Ala.

9. Способ по п.3, в котором направленный перенос фермента осуществляют к органелле, отличной от пероксисомы.

10. Способ по п.1, в котором фермент представляет собой карбоксилэстеразу и нефитотоксичная субстанция представляет собой эфир либо имазаметабенза, либо флампропа.

11. Способ по п.10, в котором нефитотоксичная субстанция представляет собой имазаметабенз-метил, флампроп-метил или флампроп-изопропил и растение представляет собой пшеницу или растение, которое аналогично пшенице, и обладает низкой видовой чувствительностью к имазаметабенз-метилу, флампроп-метилу или флампроп-изопропилу.

12. Способ по п.1, в котором фермент представляет собой оксидазу D-аминокислот, дегидрогеназу D-аминокислот или рацемазу D-аминокислот, и нефитотоксичная субстанция представляет собой либо D-энантиомер фосфинотрицина, либо D энантиомер биалафоса.

13. Способ по п.1, в котором нефитотоксичная субстанция входит в состав смеси, которая содержит фитотоксичную субстанцию, и фермент представляет собой оксидазу D-аминокислот или оксидоредуктазу, которая обладает способностью окислять аминокислоту до 2-кетокислоты, что сопровождается восстановлением кислорода до аниона пероксида.

14. Способ по п.13, в котором фермент представляет собой мутантную оксидазу D-аминокислот, получаемую из Rhodotorula gracilis, которая несет замены в положениях 213 и/или 238 по сравнению с последовательностью дикого типа, или D-аспартатоксидазу.

15. Способ по п.14, в котором оксидаза, получаемая из Rhodotorula, несет в положении 213 аминокислоту, выбранную из группы, включающей Arg, Lys, Ser, Cys, Asn и Ala, и/или в положении 238 аминокислоту, выбранную из группы, включающей His, Ser, Cys, Asn и Ala.

16. Способ по п.15, в котором смесь содержит и D-, и L- фосфинотрицин и растительный материал экспрессирует ген PAT практически только в зеленых тканях и в цветковой ткани, которая продуцирует гаметы, отличные от тех, которые становятся нефункциональными.

17. Способ по п.1, в котором фермент выбирают из группы, включающей 2-арилпропионил-СоА-эпимеразы, альфа-метилацил-СоА-рацемазы, тиоэстеразы и ацил-СоА-синтетазы, и нефитотоксичная субстанция представляет собой S-энантиомер арилоксифеноксипропионата или S-энантиомер арилоксифеноксипропионатного эфира.

18. Способ по п.17, в котором указанные S- энантиомеры арилоксифеноксипропионатов выбирают из группы, включающей S-флуазифоп, S-хизалофоп, S-пропахизафоп, S-галоксифоп, S-фенокспроп, S-дихлофоп, S-цигалофоп, S-клодинафоп.

19. Способ получения энантиомерно чистого D-фосфинотрицин (D-ФФТ), заключающийся в том, что:

(а) получают клетки, которые содержат фермент, обладающий способностью избирательно N-ацилировать ФФТ;

(б) выращивают клетки в среде, которая содержит D-L ФФТ, для получения кондиционированной среды;

(в) отделяют клетки от кондиционированной среды, указанной в (б);

(г) необязательно экстрагируют кондиционированную среду неводным, несмешивающимся с водой растворителем при различных значениях рН с тем, чтобы отделять содержащую ФФТ фракцию от фракции, которая содержит более водорастворимые молекулы, чем ФФТ;

(д) необязательно смешивают с кондиционированной или содержащими ФФТ экстрагированными средами, указанными на стадии (г), катионообменную смолу в протонированной форме в количестве и при значении рН, достаточных для абсорбции значительной части отличных от ФФТ продуктов из среды;

(е) смешивают с кондиционированной средой, экстрагированной средой или средой, полученной на стадии (д), катионообменную смолу в протонированной форме в количестве и значении рН, достаточных для того, чтобы связывать основную массу ФФТ в среде;

(ж) собирают катионообменную смолу, указанную на стадии (е), с которой связан ФФТ, и избирательно элюируют из нее ФФТ, используя среду для элюирования, которая имеет достаточное значение рН и ионной силы, при условии, что значение рН указанной среды для элюирования не является столь низким, чтобы вызывать рацемизацию элюированного ФФТ.

20. D-ФФТ имеющий энантиомерный избыток по меньшей мере 98,5%.