Рекомбинантный микроорганизм для улучшенного получения аланина - RU2018100807A
Код документа: RU2018100807A
Формула
1. Рекомбинантный микроорганизм, имеющий уменьшенную, подавленную или исключенную активность и/или экспрессию гена asd или гена gdhA.
2. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, дополнительно имеющий введенную, увеличенную или усиленную активность и/или экспрессию гена alaD.
3. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, дополнительно имеющий уменьшенную, подавленную или исключенную активность и/или экспрессию гена pflB.
4. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, дополнительно имеющий уменьшенную, подавленную или исключенную активность и/или экспрессию гена adhE.
5. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, дополнительно имеющий уменьшенную, подавленную или исключенную активность и/или экспрессию гена ldhA.
6. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, дополнительно имеющий уменьшенную, подавленную или исключенную активность и/или экспрессию гена pta и/или гена ackA.
7. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, дополнительно имеющий уменьшенную, подавленную или исключенную активность и/или экспрессию frdA.
8. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, дополнительно имеющий уменьшенную, подавленную или исключенную активность и/или экспрессию dadX.
9. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, дополнительно имеющий введенную, увеличенную или усиленную активность и/или экспрессию гена ygaW.
10. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, дополнительно имеющий введенную, увеличенную или усиленную активность и/или экспрессию гена zipA.
11. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, дополнительно имеющий введенную, увеличенную или усиленную активность и/или экспрессию гена lpd.
12. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, дополнительно имеющий уменьшенную, подавленную или исключенную активность и/или экспрессию гена brnQ.
13. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, дополнительно содержащий мутированный ген lpxD.
14. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, дополнительно имеющий введенную, увеличенную или усиленную активность и/или экспрессию гена gcvA.
15. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, дополнительно имеющий уменьшенную, подавленную или исключенную активность и/или экспрессию гена gcvB.
16. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, где ген asd или ген gdhA выбран из группы
(i) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 37, или
(ii) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 37, или
(iii) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 37 при жестких условиях, или
(iv) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO:38, или
(v) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 60% гомологичность с полипептидом SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 38.
17. Рекомбинантный микроорганизм по п. 2, где ген alaD выбран из группы, состоящей из
(AA) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 1, или
(BB) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, или
(CC) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 1, при жестких условиях, или
(DD) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 2, или
(EE) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 60% гомологичность с полипептидом SEQ ID NO: 2.
18. Рекомбинантный микроорганизм по п. 3, где ген pflB выбран из группы, состоящей из
(A) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 5, или
(B) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5, или
(C) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 5, при жестких условиях, или
(D) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 6, или
(E) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 60% гомологичность с полипептидом SEQ ID NO: 6.
19. Рекомбинантный микроорганизм по п. 4, где ген adhE выбран из группы, состоящей из
(F) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 7, или
(G) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7, или
(H) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 7, при жестких условиях, или
(I) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 8, или
(J) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 60% гомологичность с полипептидом SEQ ID NO: 8.
20. Рекомбинантный микроорганизм по п. 5, где ген ldhA выбран из группы, состоящей из
(K) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 9, или
(L) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 9, или
(М) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 9, при жестких условиях, или
(N) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 10, или
(О) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 60% гомологичность с полипептидом SEQ ID NO: 10.
21. Рекомбинантный микроорганизм по п. 6, где ген pta выбран из группы, состоящей из
(P1) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 11, или
(Q1) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 11, или
(R1) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 11, при жестких условиях, или
(S1) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 12, или
(T1) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 60% гомологичность с полипептидом SEQ ID NO: 12, и где ген ackA выбран из группы, состоящей из
(P2) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 32, или
(Q2) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 32, или
(R2) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 32, при жестких условиях, или
(S2) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 33, или
(T2) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 60% гомологичность с полипептидом SEQ ID NO: 33.
22. Рекомбинантный микроорганизм по п. 7, где ген frdA выбран из группы, состоящей из
(U) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 13, или
(V) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13, или
(W) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 13, при жестких условиях, или
(X) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 14, или
(Y) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 60% гомологичность с полипептидом SEQ ID NO: 14.
23. Рекомбинантный микроорганизм по п. 8, где ген dadX выбран из группы, состоящей из
(Z) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 15, или
(FF) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, или
(GG) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 15, при жестких условиях, или
(НН) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 16, или
(II) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 60% гомологичность с полипептидом SEQ ID NO: 16.
24. Рекомбинантный микроорганизм по п. 9, где ген ygaW выбран из группы, состоящей из
(JJ) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 17, или
(KK) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17, или
(LL) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 17, при жестких условиях, или
(MM) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 18, или
(NN) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 60% гомологичность с полипептидом SEQ ID NO: 18.
25. Рекомбинантный микроорганизм по п. 10, где ген zipA выбран из группы, состоящей из
(OO) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 19, или
(PP) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, или
(QQ) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 19, при жестких условиях, или
(RR) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 20, или
(SS) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 60% гомологичность с полипептидом SEQ ID NO: 20.
26. Рекомбинантный микроорганизм по п. 11, где ген lpd выбран из группы, состоящей из
(TT) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 21, или
(UU) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21, или
(VV) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 21, при жестких условиях, или
(WW) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 22, или
(XX) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 60% гомологичность с полипептидом SEQ ID NO: 22.
27. Рекомбинантный микроорганизм по п. 12, где ген brnQ выбран из группы, состоящей из
(YY) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 23, или
(ZZ) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23, или
(AAA) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 23, при жестких условиях, или
(ВВВ) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 24, или
(CCC) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 60% гомологичность с полипептидом SEQ ID NO: 24.
28. Рекомбинантный микроорганизм по п. 13, где ген lpxD выбран из группы, состоящей из
(DDD) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 27, или
(EEE) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 28.
29. Рекомбинантный микроорганизм по п. 14, где ген gcvA выбран из группы, состоящей из
(FFF) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 29, или
(GGG) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 29, или
(HHH) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 29, при жестких условиях, или
(III) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 30, или
(JJJ) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 60% гомологичность с полипептидом SEQ ID NO: 30.
30. Рекомбинантный микроорганизм по п. 15, где ген gcvB выбран из группы, состоящей из
(KKK) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность SEQ ID NO: 31, или
(LLL) молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 31, или
(МММ) молекулы нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 31, при жестких условиях.
31. Рекомбинантный микроорганизм по любому из пп. 1-30, где микроорганизм выбран из рода группы, состоящей из Corynebacterium, Bacillus, Erwinia, Escherichia, Pantoea, Streptomyces, Zymomonas, Rhodococcus, Saccharomyces, Candida или Pichia.
32. Композиция, содержащая один или более рекомбинантных микроорганизмов по любому из пп. 1-31.
33. Композиция по п. 32, дополнительно содержащая среду и источник углерода.
34. Способ получения рекомбинантного микроорганизма с увеличенным выходом и/или производительностью аланина, который включает следующие стадии:
(I) уменьшение, подавление или исключение активности и/или экспрессии гена, как определено в п. 1 или 16, в микроорганизме; и
(II) получение рекомбинантного микроорганизма с увеличенным выходом и/или производительностью аланина по сравнению с эталонным микроорганизмом, без уменьшенной, подавленной или исключенной активности и/или экспрессии гена, как определено в п. 1 или 16.
35. Способ по п. 34, в котором рекомбинантный микроорганизм, применяемый в указанном способе, дополнительно содержит измененную активность и/или экспрессию по меньшей мере одного гена, как определено в одном из пп. 2-15 и 17-30.
36. Способ по любому из пп. 34 или 35, в котором микроорганизм выбирают из рода группы, состоящей из Corynebacterium, Bacillus, Erwinia, Escherichia, Pantoea, Streptomyces, Zymomonas, Rhodococcus, Saccharomyces, Candida или Pichia.
37. Способ получения аланина, включающий культивирование одного или более рекомбинантного микроорганизма по любому из пп. 1-30 в условиях, которые позволяют получение аланина.
38. Способ по п. 37, в котором микроорганизм культивируют в среде, содержащей от 0,5% до 30% (мас./об.) сахара.
39. Способ по п. 37, в котором выход аланина составляет по меньшей мере 80%.
40. Способ по п. 37, в котором хиральная чистота L-аланина составляет по меньшей мере 95%.
41. Способ по любому из пп. 37-40, в котором получают хирально чистый L-аланин.
42. Способ культивирования или выращивания генетически модифицированного микроорганизма, включающий инокуляцию культуральной среды одним или более генетически модифицированными микроорганизмами по любому из пп. 1-30 и культивирование или выращивание указанного генетически модифицированного микроорганизма в культуральной среде.
43. Применение рекомбинантного микроорганизма по любому из пп. 1-30 или композиции по 32 или 33 для ферментативного получения аланина.
44. Способ ферментативного получения аланина, включающий стадии
I) выращивание микроорганизма по любому из пп. 1-30 в ферментере, и
II) выделение аланина из ферментативного бульона, полученного на стадии I).
