Код документа: SU1322984A3
113
Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и касается получения фермента, пригодного для количественного определения пирувата и пируват- образуюших ферментов.
Цель иобретения - повьт1ение стабильности и достоверности результатов определения за счет предотвращения образования осадков и помутнений.
Способ определения пйрувата в биологических пробах заключается в том, что в состав реактива для определения пирувата входит фермент пируватокси- да, активный без добавления флавин- адепнндинуклеотида (FAD), тиамин-пи- рофосфата (ТРР) и двухвалентных ионов металлов. Пируватоксидаза оптимально активна при рН 5,7, оптимально стабильна при рН 5,6-5,8 и, что особенно важно, при применении фермента константа Михаэлиса равна 0,4 ммоль/л для пирувата и 2, 3 ммол ь/л для фосфата, мол.м. фермента 146000 дальтон, что мрньше известного фермента (190000).
Полученный фермент более специфичен к субстрату по сравнению с известным .
Характеристики специфичности представлены в табл.1.
Влияние ингибиторов на активность предлагаемого фермента, используемог для определения пирувата, показано в табл.2.
Ингибирующее действие ЕДТА на предлагаемую пируватоксидазу в 1000 раз слабее, чем в случае известного фермента, а после многодневного диализа фермента благодаря добавке ТРР FAD и Мп активность повышается на 5-15Z, в то время как известный фермент без этих активаторов неактивен.
В качестве источника фермента используют штаммы молочно-кислых бактерий Lactobacillus plantarum DSM 2571, Lbc. Salivarius DSM 2573, Le- uconosboc mesenteroides DSM 2572 и/или Streptococcus cremoris DSM 2574, хранящиеся в Национальной коллекции микроорганизмов.
Обогащение и очистку фермента осуществляют обычными биохимическими методами . Можно достигнуть 20-30-кратного обогащения до достижения удельной активности 6-9 ед/мг протеина. Полученная пируватоксидаэа входит в состав реактива для определения пирувата в анализируемых пробах.
42
Предпочтительный состав реактива: 1-50 ед/нл пируватоксидазы, 10 - 50 ммоль/л фосфата, буфер рН 6-8 (любое пригодное буферное вещество, буферирующее в указанных рН-областях, в которых фермент активен и стабилен ) . Хорошо пригоден фосфатный буфер и 0,22 ед/мл пероксидазы (РОД). Использование в составе реактива
предлагаемого фермента обеспечивает более высокую способность его к хранению .
Выделение пируватоксидазы (Py-OD) из Lactobacillusplantarum DSM 2571
осуществляется следующим образом.
1. Культивирование. Среда для культивирования содержит, г/л воды: бакто-триптон-оксоид Ю;дрожжевой экстракт оксоида 4; х 3 2;
диаммоний-гидроцитрат 2; твин-80 (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат) 1 мл; MgSO X 7 Н,0 0,2; MnSO х X 0,2; сульфид молибдена 0,2; лактоза 10; пировиноградная кислота
3,2; рН 7.
150 мл среды указанного состава или обычной для бактерий молочной кислоты MRS-среды засевают культурами путем укола и встряхивают при
28°С. После происшедшего роста
150 мл указанной среды засевают 15% вьфащенной культуры и встряхивают в колбе Эрленмейера емкостью 500 мл при 28 С вплоть до завершения поздней
лаг-фазы.
MRS-среда составляется следующим образом, г/л: мясной экстракт (MERCK) 2; пептон из казеина 10; trypish дрожжевой экстракт 4; глюкоза 20; твин-80 1 мл; хЗ 2,5; Na-ацетат х 3 5; диаммоний- цитрат 2; MgSO х 7 200 мг; MnSO+ X 50 мг. I
2. Вьщеление. Из 50 л культураль- ной жидкости Lactobacillus DSM 2571 со 120 ед/л пируватоксидазы (Py-OD) собиают 300 г влажной массы путем центрифугирования. 100 г клеток помещают в стеклянную диномельницу,
после добавки 4% полиэтиленимина центрифугируют и надосадочную жидкость обрабатьшают фракционированием сульфатом аммония (25-65%) при рН 6,3,
хроматографированием с помощью дек- странблау-сефарозы (фирма Farmacia), второго фракционирования с помощью сульфата аммония при 20-30% (насыщения ) и путем пропускания через мопекулярное сито Сефадекс АСА (фирмы LKB
Данные обогащения представлены в табл . 3,
Очищенный фермент имеет удельную активность 5,8 ед/мг и содержит менее чем 0,037, Аро-глутамат-пируват- трансаминазы об -кетоглутаратокси- дазы, а также менее 0,002% NADH-ок- сидазы.
Активность пируватоксидазы определяют при следующие: условиях: + Р. - ILO
Oj Ру - OD ацетил-Р +
COj -t г 2
нина содержит.200 ммоль/л аланинсуль- финовой кислоты, в тех же условиях, как и в примере 1, добавляют GOT-co- держащую пробу. Из измеаеиия экстинк- с ции В 1 мин рассчитывают содержание GOT.
П р и м е р 3. Тест-полосы для GPT.
Для приготовления тест-полос GPT 10 пропитывают две бумаги.
Ферментная бумага: 0,5 моль/л мор- фолинзтансульфокислота (гидроксид калия, рН 6,5 (MORS-буфер); 800 ммоль/л аланина; 1 ммоль/л гидрофосфата ка- 15 лия; 20 000 ед/л P0D; 200000 ед/л пируватоксидазы.
С помощью этого раствора пропитывают адсорбирующую бумагу толщиной 50 ммк, с поверхностной плотностью
HjO ч- 4-аминоантипирин (4-АА) + + 2 окси-3,5-дихлорбензол сульфокис- лота (HDBS) РОР хиноновый краситель (546 им) -ь 2 .
. потребляется эквимолярным ко-20 12 г/м, поглотительной способностью
50 г HjO/M , и высушивают в течение 5 мин при (например, ситчатая бумага для чая Teebeutelpapier фирмы Scholler and Hosch). Бумагу затем 25 разрезают на полосы щириной 1 см.
Индикаторная бумага: 10 ммоль/л 4,5-(4-диметиламино-фе нил)-2-(3,5- -диметокси-4-оксифе11Ил) имидазола и 18 ммоль/л « -кетоглутаровой кисло- ществляется путем добавки 0,05 мкмольЗО ты растворяют в 100 ммоль/л НС1 (бу- пирувата, соответственно содержащей ферная система), пируват-пробы, в кювету объемом 2 мл
при толщине слоя 1 см и температуре помощью этого раствора также про- jj°(питывают соответствующую адсорбируюРеакция спустя 15 мин прекращав -я 35 бумагу, высушивают в течение Коэффициент экстинкции при 546 нм мин при 30 С и разрезают на полосы
Н,0, личеством красителя.
1 ед. Py-OD 1 мкмоль превращения пирувата в 1 мин при 25 С.
Определение пирувата: 72 ммоль калийсофатного буфера, рН 6,7; 8 ммоль 4-АА; 6,8 ммоль/л HDBS; 0,01 ммоль/л FAD; 2 ед. POD; 10 ед, Py-OD на 1 мл. Старт для последовательности до целевого значения осушириной 1 см. Прозрачную поликарбонатную пленку толщиной 10 ммк вместе с индикаторной бумагой и фермент- Q ной бумагой наносят с одной стороны на пластиковые полосы (ленты), укрепляют так, что пленка прилегает снаружи , индикаторная бумага в середине, ферментная бумага внутри. Наряду с
6 16,5 см (мкмоль измеряется для чистого пирувата - мононатриевая соль).
Пример 1. Кинетическое определение пирувата (GPT).
К 2,5 мл раствора, содержащего, ммоль/л: КН,РО (рН 6,7) 80; аланин
шириной 1 см. Прозрачную поликарбонатную пленку толщиной 10 ммк вместе с индикаторной бумагой и фермент Q ной бумагой наносят с одной стороны на пластиковые полосы (ленты), укреп ляют так, что пленка прилегает снару жи, индикаторная бумага в середине, ферментная бумага внутри. Наряду с
t-ti-if j л tj г -j л «iVii-Аъ Л1 f / v.v/ njictnnn
800; N-(3 -сульфонил-4-окси-5 -хлор- 5 им наносят шириной 15 мм прочес из фенил)-4-аминоантипирин 0,2; л -ке- стекловолокна, толщиной 1,5 мм, с тоглутаровая кислота 18, а также пируватоксидаза 0,2 ед/мл; перокси- даза 2 ед/мл, добавляют 0,1 мл пробы. Спустя 3 мин определяют изменение экстинкции в 1 мин. Температура измерения составляет 25 С, длина волны 546 нм, составляет 19,6, обпщй объем 2,6 мл и объем пробы 0,1 мл. Из прироста экстинкции в 1 мин рассчи- тьшают активность на GPT.
П р и м е р 2. Кинетическое определение GOT. В исходную смесь, аналогичную примеру 1, которая вместо алатолщиной волокон примерно 2 мкм, так что свободный конец пленки и пропитанная бумага выступают еще на 6 мм
50 над прочесом (ваточным холстом). Затем все разрезают на тест-полосы шириной 6 мм. Если наносят 15 мкл цельной крови на участок для нанесения пробы, то в течение 45 с доля плазмы
проникает через стекловолокнистый прочес под прозрачную пленку, в то время как эритроциты удерживаются на месте нанесения. После прижатия пленки ферментная и индикаторная бумаги
нина содержит.200 ммоль/л аланинсуль- финовой кислоты, в тех же условиях, как и в примере 1, добавляют GOT-co- держащую пробу. Из измеаеиия экстинк- ции В 1 мин рассчитывают содержание GOT.
П р и м е р 3. Тест-полосы для GPT.
Для приготовления тест-полос GPT пропитывают две бумаги.
Ферментная бумага: 0,5 моль/л мор- фолинзтансульфокислота (гидроксид калия, рН 6,5 (MORS-буфер); 800 ммоль/л аланина; 1 ммоль/л гидрофосфата ка- лия; 20 000 ед/л P0D; 200000 ед/л пируватоксидазы.
С помощью этого раствора пропитывают адсорбирующую бумагу толщиной 50 ммк, с поверхностной плотностью
12 г/м, поглотительной способностью
бумагу, высушивают в течение мин при 30 С и разрезают на полосы
шириной 1 см. Прозрачную поликарбонатную пленку толщиной 10 ммк вместе с индикаторной бумагой и фермент- ной бумагой наносят с одной стороны на пластиковые полосы (ленты), укрепляют так, что пленка прилегает снаружи , индикаторная бумага в середине, ферментная бумага внутри. Наряду с
им наносят шириной 15 мм прочес из стекловолокна, толщиной 1,5 мм, с им наносят шириной 15 мм прочес из стекловолокна, толщиной 1,5 мм, с толщиной волокон примерно 2 мкм, так что свободный конец пленки и пропитанная бумага выступают еще на 6 мм
над прочесом (ваточным холстом). Затем все разрезают на тест-полосы шириной 6 мм. Если наносят 15 мкл цель ной крови на участок для нанесения пробы, то в течение 45 с доля плазмы
проникает через стекловолокнистый прочес под прозрачную пленку, в то время как эритроциты удерживаются на месте нанесения. После прижатия пленки ферментная и индикаторная бумаги
соприкасаются с освободившейся плазмой и равномерно увлажняются, Содерж пщйся в плазме пируват (GPT) реагирует с синим окрашиванием, интенсивность которого пропорциональна количеству (измерению) GPT и при известных условиях может измеряться в ремис- сионном фотометре. Таким же оС5разом реагируют другие испытуемые материалы , такие, как сыворотка, плазма и т.д.
П р и м е р 4. Тест-полосы на GOT
Тест-полосы на СОТ готовятся так же, как и полосы на ОРТ согласно примеру 3, только в ферментной бумаге вместо аланина содержатся 200 ммоль апанинсульфокислоты. Получающееся после прижатия прозрачной пленки синее окрашивание является мерой количества GOT в пробе,
П р и м е р 5. Сравнение результатов измерений при применении предлагаемого способа и известного после хранения примененных реактивов.
Для сравнения применяют:
реактив по примеру 3;
реактив по примеру 3, но бумагу вместо 200 000 ед/л предлагаемой пи- руватоксидазы пропитывают 200000 ед/л известной пируватоксидазы, а также дополнительно 1 ммоль/л пиаминпифос- фатом (ТРР) и 0,5 ммоль/л №i -ионо
При помощи этих реактивов исследуют 3 пробы с пируватом до и после хранения, которые показывают различную активность ОРТ. Измерение проводят согласно примеру 3,
Результаты испытаний представлены в табл.4.
Из табл.4 следует, что по предлагаемому способу и после хранения реактива для определения пирувата величина измеряемых значений существенно не отклоняется от базового значения, в то время как согласно известному способу результаты измерения после хранения в течение 3 дней при 60 С отклоняются от базовых значений до 60%.
Аналогичные результаты получают и в том случае, если вместо реактива для определения пирувата согласно примеру 3 используют реактив согласно примеру 1, который перед хранени- ем лиофилизируют.
29846
Таким образом, предлагаемый способ определения пирувата в биологических объектах обеспечивает достоверность результатов. Способ пригоден
и для определения субстратов и
ментов, который приводят к образованию пирувата,
10
Формула изобретения
0
Способ определения пирувата в биологических объектах, предусматривающий взаимодействие исследуемой пробы с реактивом, содержащим пируватокси5 дазу, буфер, пероксидазу, 4-аминоантипиран , и сульфокислоту, последую- щий анализ его количества путем регистрации образующейся перекиси водорода , отличающийся тем,
0 что, с целью повышения стабильности и достоверности результатов определения за счет предотвращения образования осадков и помутнений, используют пи- руватоксидазу, вьщеленную из молочно-кислых бактерий штаммов Lactoba- cillua plantarum DSM 2571, или Lbc. saliyarius DSM 2573, или Leuconosboc nleeenteroides DSM 2572, или Streptococcus сгепюг18 DSM 2574, характеризующуюся оптимумом активности при рН 5,7, оптимумом стабильности при рН 5,6-5,8, константой Михаэлиса для пирувата при 25°С 0,4 ммодь/л, дпя фосфата 2,3 ммоль/л, мол.м, 146000
5 дальтон при определении в центрифуге
дтее
Таблиц
по
1
40
Специфичность к субстрату,%
Ингибитор
Без ингибитора
KCN
NaN, ЕДТА
Растворение - надоса- дочная жидкость
Фракционирование с сульфатом аммония
декстранблау-сефароза
Фракционирование с сульфатом аммония
АСА Э4-мол-сита
Активность фермента, %
предлагаемого
О
10
100
100
,01
,1
1
10
100
85
О
75
78
30
7
О
100
75
5
62
100
100
98
85
Таблица 3
67000,37100
55400,4497
25600,8991
7531,030
1025,823,5
27 27,5 29 12
60 62 59 28
212 209 211 81
Редактор Н.Тупица
Составитель И.Привалова
Техред М.Моргентал Корректор А.Тяско
Заказ 2883/59 Тираж 499Подписное
BH№fflH Государственного комитета СССР
по делам изобретений н открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,д.4/5
- ---- - - - - .-i-. «. - -«.- -.«-..«.«... .ч.я «««...
Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная,А
Изобретение относится к биохиъши: и биотехнологии и обеспечивает повышение стабильности и достоверности результатов определения за счет предотвращения образования осадков и помутнений . Способ заключается в том, что в состав реактива для определения целевого продукта входит пируватокси- даза, характеризующаяся оптимумом активности при рН 5,7, оптимумом стабильности при рН 5,6-5,8, константой Михаэлиса для пирувата при 25 С 0,4 ммоль/л, для фосфата 2,3 ммоль/л, мол.м 146000 дальтон при определении в центрифуге по , вьщеленная из штаммов мелочно-кислых бактерий Са ctobacillus DSM 2671, Lbc. salivari- U8 DSM 2573, Leuconostoc mesentero- ideB DSM 2572 и/или Streptococcus creraoris DSM 2574. 4 табл.
Комментарии