Дрожжи, продуцирующие метионин - RU2020105358A

1. Рекомбинантные дрожжи, продуцирующие метионин и/или производные метионина, в геноме которых

(A) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, и/или по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, которая может использовать в качестве кофермента как NAD (никотинамидадениндинуклеотид), так и NADP (никотинамидадениндинуклеотидфосфат), сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

(B) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартокиназу, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора; и

(C) (i) a) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу MET2, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

и/или по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу METX, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и

b) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая метионинсинтазу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;

и/или (ii) a) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосеринкиназу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и

b) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая цистатионин-гамма-синтазу 1, обладающую улучшенной O-фосфо-L-гомосерин (OHPS)-зависимой метионинсинтазной активностью, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

2. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, в геноме которых по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартаттрансаминазу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

3. Рекомбинантные дрожжи по п. 1 или 2, в геноме которых по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая глутаматдегидрогеназу, превращающую оксоглутарат в глутамат, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

4. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-3, в геноме которых по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосериндегидрогеназу, сверхэкспрессируется.

5. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-4, в геноме которых независимо друг от друга: (i) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие S-аденозилметионинсинтазу SAM1 и/или SAM2, были удалены, или (ii) по меньшей мере одна, предпочтительно все нуклеиновые кислоты, кодирующие S-аденозилметионинсинтазу SAM1 и/или SAM2, находятся под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора и/или находятся в дестабилизированной форме.

6. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-5, в геноме которых независимо друг от друга: (i) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие ген ароматической аминотрансферазы I ARO8 и/или цитозольной аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью (BCAA) BAT2, были удалены, или (ii) по меньшей мере одна, предпочтительно все нуклеиновые кислоты, кодирующие ген ароматической аминотрансферазы I ARO8 и/или цитозольной аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью (BCAA) BAT2, находятся под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора и/или находятся в дестабилизированной форме.

7. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-5, в геноме которых независимо друг от друга: (i) по меньшей мере одна, предпочтительно все нуклеиновые кислоты, кодирующие ароматическую аминотрансферазу I ARO8, и/или

(ii) по меньшей мере одна, предпочтительно все нуклеиновые кислоты, кодирующие ген цитозольной аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью (BCAA) BAT2, сверхэкспрессируются и/или находятся под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

8. Рекомбинантные дрожжи по п. 7, в геноме которых по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу 2-гидроксикислот (KDH), сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

9. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-8, в геноме которых по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая цистатионин-гамма-лиазу CYS3, независимо находится под контролем слабого промотора, или индуцибельного, или репрессируемого промотора, и/или находится в дестабилизированной форме.

10. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-9, в геноме которых по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая цистатионин-бета-синтазу CYS4, независимо находится под контролем слабого промотора, или индуцибельного, или репрессируемого промотора, и/или находится в дестабилизированной форме.

11. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-10, в геноме которых a) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу MET2, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу METX, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и b) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая O-ацетилгомосерин-O-ацетилсеринсульфгидрилазу MET17, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.

12. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-11, в геноме которых по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосеринкиназу THR1, независимо находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора и/или находится в дестабилизированной форме.

13. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-12, в геноме которых была выполнена по меньшей мере одна из следующих модификаций (A) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие общую пермеазу аминокислот AGP3, были удалены из генома дрожжей, и, необязательно (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая общую пермеазу аминокислот AGP3, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или (ii) была вставлена по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную общую пермеазу аминокислот AGP3; (B) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие пермеазу 3 аминокислот с разветвленной цепью BAP3, были удалены из генома дрожжей, и, необязательно (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая пермеазу 3 аминокислот с разветвленной цепью BAP3, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или (ii) была вставлена по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную пермеазу 3 аминокислот с разветвленной цепью BAP3; (C) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие пермеазу 2 аминокислот с разветвленной цепью BAP2, были удалены из генома дрожжей, и, необязательно (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая пермеазу 2 аминокислот с разветвленной цепью BAP2, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или (ii) была вставлена по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную пермеазу 2 аминокислот с разветвленной цепью BAP2; (D) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие общую пермеазу аминокислот GAP1, были удалены из генома дрожжей, и, необязательно (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая общую пермеазу аминокислот GAP1, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или (ii) была вставлена по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную общую пермеазу аминокислот GAP1; (E) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1, были удалены из генома дрожжей, и, необязательно (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или (ii) была вставлена по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1; (F) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие общую пермеазу аминокислот AGP1, были удалены из генома дрожжей, и, необязательно (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая общую пермеазу аминокислот AGP1, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или (ii) была вставлена по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную общую пермеазу аминокислот AGP1; (G) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие низкоаффинную пермеазу метионина MUP3, были удалены из генома дрожжей, и, необязательно (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая низкоаффинную пермеазу метионина MUP3, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или (ii) была вставлена по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную низкоаффинную пермеазу метионина MUP3; (H) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие высокоаффинную пермеазу метионина MUP1, были удалены из генома дрожжей, и, необязательно (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая высокоаффинную пермеазу метионина MUP1, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или (ii) была вставлена по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную высокоаффинную пермеазу метионина MUP1; (I) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая вероятный транспортер AQR1, сверхэкспрессируется; и/или (J) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая транспортер полиаминов 1 TPO1, сверхэкспрессируется.

14. Рекомбинантные дрожжи по п. 13, в геноме которых были выполнены по меньшей мере две, предпочтительно по меньшей мере три из модификаций, указанных в п. 8.

15. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-14, где нуклеиновая кислота, кодирующая аспартокиназу HOM3, представляет собой нуклеиновую кислоту из дрожжей, предпочтительно из Saccharomyces cerevisiae.

16. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-15, где нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу METX, представляет собой нуклеиновую кислоту из бактерии, предпочтительно из бактерии, независимо выбранной из группы, состоящей из Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Haemophilius influenza, Streptomyces lavendulae, Leptospira interrogans, Streptococcus pneumonia и Mycobacterium tuberculosis.

17. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-16, где нуклеиновая кислота, кодирующая мутированную цистатионин-гамма-синтазу 1 CGS1, представляет собой нуклеиновую кислоту, происходящую из растения, и предпочтительно представляет собой цистатионин-гамма-синтазу 1 из Arabidopsis thaliana.

18. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-17, где вставленная по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая S-аденозилметионин SAM1 и/или SAM2, цистатионин-гамма-лиазу CYS3, цистатионин-бета-синтазу CYS4, гомосеринкиназу THR1, общую пермеазу аминокислот AGP3, пермеазу 3 аминокислот с разветвленной цепью BAP3, пермеазу 2 аминокислот с разветвленной цепью BAP2, общую пермеазу аминокислот GAP1, высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1, общую пермеазу аминокислот AGP1, низкоаффинную пермеазу метионина MUP3 и высокоаффинную пермеазу метионина MUP1, независимо представляют собой нуклеиновую кислоту из дрожжей, предпочтительно из Saccharomyces cerevisiae.

19. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-18, где сильный промотор независимо выбран из группы, состоящей из pTDH3, pENO2, pTEF-KI, pTEF3, pTEF1, pADH1, pGMP1, pFBA1, pPDC1, pCCW12 и pGK1.

20. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-19, где индуцибельный или репрессируемый промотор независимо выбран из группы, состоящей из промоторов, индуцируемых или репрессируемых медью, промоторов, индуцируемых или репрессируемых метионином, и промоторов, индуцируемых или репрессируемых треонином, предпочтительно выбран из группы, состоящей из pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5 и pCHA1.

21. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-20, где слабый промотор независимо выбран из группы, состоящей из pURA3, pRPLA1, pNUP57 и pGAP1.

22. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 1-21, где индуцибельный или репрессируемый промотор независимо выбран из группы, состоящей из промоторов, индуцируемых или репрессируемых медью, промоторов, индуцируемых или репрессируемых лизином, и промоторов, индуцируемых или репрессируемых метионином, предпочтительно выбран из группы, состоящей из pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 и pMLS1.

23. Способ получения метионина и/или по меньшей мере одного из его производных, включающий следующие стадии: (a) культивирование рекомбинантных дрожжей по любому из пп. 1-22 в культуральной среде, предпочтительно содержащей MeSH, MeSNa и/или MeSMe; и (b) выделение метионина и/или по меньшей мере одного из его производных из указанной культуральной среды.

24. Способ по п. 23, где культуральная среда содержит по меньшей мере источник углерода, предпочтительно источник углерода, выбранный из группы, состоящей из глюкозы и сахарозы.

25. Применение рекомбинантных дрожжей по любому из пп. 1-22 для получения метионина и/или его производных, предпочтительно для получения метионина и/или 2-гидрокси-4-(метилтио)бутановой кислоты (HMB) и/или 2-кето-4-метилтиомасляной кислоты (KMB), предпочтительно для получения метионина и/или 2-гидрокси-4-(метилтио)бутановой кислоты (HMB).