Способ получения ацетоина - RU2017101673A
Код документа: RU2017101673A
Формула
1. Рекомбинантные дрожжи, имеющие пониженную активность пируватдекарбоксилазы, в геном которых вставлена:
- одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу или ALS,
- одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатдекарбоксилазу или ALD, и
- одна или более копий нуклеиновых кислот, кодирующих NADH-оксидазу или NOXE.
2. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что указанные рекомбинантные дрожжи включают одну или более ДНК-конструкций, выбранных из группы, включающей следующие формулы:
(I) 5'-[ген 1]х1-3' и 5'-[ген 2]х2-3' и 5'-[ген 3]х3-3',
(II) 5'-[ген 1]x1-[ген 2]х2-3' и 5'-[ген 3]х3-3',
(III) 5'-[ген 1]х1-[ген 2]х2-[ген 3]х3-3', и
их комбинацию, где:
- "ген 1" обозначает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS, ALD или NOXE;
- "ген 2" обозначает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS, ALD или NOXE, но отличающуюся от гена 1;
- "ген 3" обозначает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS, ALD или NOXE, но отличающуюся от генов 1 и 2;
- "ALS" представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую ацетолактатсинтазу;
- "ALD" представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую ацетолактатдекарбоксилазу;
- "NOXE" представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую NADH-оксидазу;
- каждое из "х1", "х2" и "х3" независимо друг от друга представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 50, предпочтительно от 0 до 20, и,
при условии, что указанные рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую каждую из ALS, ALD и NOXE.
3. Рекомбинантные дрожжи по п. 2, отличающиеся тем, что указанные рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере одну ДНК-конструкцию формулы (II), где "ген 3" обозначает нуклеиновую кислоту, кодирующую NADH-оксидазу.
4. Рекомбинантные дрожжи по п. 2, отличающиеся тем, что указанные рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две ДНК-конструкции формулы (IIa), идентичные или отличающиеся, причем каждая формула (IIa) имеет следующую формулу:
(IIа) 5'-[(пром5)y1-ген 1-терм5]х5-[пром1-ген 1-терм1]х1-[пром2-ген 2-(терм2)z1]х2-3' и 5'-[(пром3)у2-ген 3-(терм3)z2]х3-3',
где:
- ген 1, ген 2 и ген 3 являются такими, как определено в п. 2 или 3, и "х1", "х2" и "х3" являются такими, как определено в п. 2;
- "х5" представляет собой целое число, равное 0 или 1;
- "у1", "у2", "z1" и "z2", каждое независимо от других представляет собой целое число, равное 0 или 1;
- когда указанные рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере две ДНК-конструкции формулы (IIa), то "х1", "х2", "х3", "х5", "у1", "у2", "z1" и "z2" могут быть идентичными или отличающимися;
- "пром1" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ген 1;
- "пром2" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ген 2;
- "пром3" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ген 3;
- "пром5" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию гена 1, причем указанный пром5 является идентичным или отличающимся от пром1;
- "терм1" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ген 1;
- "терм2" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ген 2;
- "терм3" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ген 3;
- "терм5" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию гена 1, причем указанный терм5 является идентичным или отличающимся от терм1.
5. Рекомбинантные дрожжи по п. 2, отличающиеся тем, что указанные рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две ДНК-конструкции формулы (IIb), идентичные или отличающиеся, причем каждая формула (IIb) имеет следующую формулу:
(IIb) 5'-[(пром5)y1-ALS-терм5]x5-[пром1-ALS-терм1]x1-[пром2-ALD-(терм2)z1]х2-3' и 5'-[(пром3)y2-NOXE-(терм3)z2]х3-3',
где:
- ALS, ALD и NOXE являются такими, как определено в любом из пп. 1-4; "х1", "х2" и "х3" являются такими, как определено в п. 2; и "х5" и "у1", "у2", "z1" и "z2" являются такими, как определено в п. 4;
- когда указанные рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере две ДНК-конструкции формулы (IIb), то "х1", "х2", "х3", "х5", "у1", "у2", "z1" и "z2" могут быть идентичными или отличающимися;
- "пром1" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу;
- "пром2" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатдекарбоксилазу;
- "пром3" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей NADH-оксидазу;
- "пром5" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу, причем указанный пром5 является идентичным или отличающимся от пром1;
- "терм1" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу;
- "терм2" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатдекарбоксилазу;
- "терм3" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей NADH-оксидазу; и
- "терм5" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу, причем указанный терм5 является идентичным или отличающимся от терм1.
6. Рекомбинантные дрожжи по п. 2, отличающиеся тем, что рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере две ДНК-конструкции формулы (II), (IIa) или (IIb), при условии, что все копии нуклеиновой кислоты NOXE расположены в одной из по меньшей мере двух ДНК-конструкций формулы (II), (IIa) или (IIb).
7. Рекомбинантные дрожжи по п. 2, отличающиеся тем, что указанные рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере две, предпочтительно строго две ДНК-конструкции следующих формул (IIc) и (IId):
(IIc) 5'-[(пром5)y1-ALS-терм5]x5-[пром1-ALS-терм1]x1-[пром2-ALD-(терм2)z1]х2-3' и 5'-[(пром3)y2-NOXE-(терм3)z2]х6-3'; и
(IId) 5'-[(пром5)y1-ALS-терм5]x5-[пром1-ALS-терм1]x1-[пром2-ALD-(терм2)z1]х2-3' и 5'-[(пром3)y2-NOXE-(терм3)z2]x7-3',
где:
- ALS, ALD и NOXE являются такими как определено в любом из пп. 1-6, "пром1", "пром2", "пром3", "пром5", "терм1", "терм2", "терм3" и "терм5" являются такими, как определено в п. 4 или 5; "х1", "х2" и "х3" являются такими, как определено в п. 2; и "х5", "у1", "у2", "z1" и "z2" являются такими, как определено в п. 4;
- "х1"-"х3", "х5", "у1", "у2", "z1" и "z2" для каждой из формул (IIc) и (IId) являются идентичными или отличающимися; и
- "х6" и "х7" представляют собой целые числа от 0 до 50, предпочтительно от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 12, более конкретно от 2 до 5, предпочтительно от 3 до 4, а еще лучше равные 3, при условии, что одно из "х6" и "х7" представляет собой 0.
8. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что нуклеиновая(ые) кислота(ы), кодирующая(ие) ацетолактатсинтазу или ALS, представляет/представляют собой нуклеиновую(ые) кислоту(ы), выбранную(ые) из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 80% идентичность нуклеиновых кислот с последовательностями нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
9. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что нуклеиновая(ые) кислота(ы), кодирующая(ие) ацетолактатдекарбоксилазу или ALD, представляет/представляют собой нуклеиновую(ые) кислоту(ы), выбранную(ые) из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 36%, предпочтительно по меньшей мере 80% идентичность нуклеиновых кислот с последовательностями нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 7, 9 и 11.
10. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что нуклеиновая кислота(ы), кодирующая(ие) NADH-оксидазу или NOXE, представляет/представляют собой нуклеиновую(ые) кислоту(ы), выбранную(ые) из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 78%, предпочтительно по меньшей мере 80% идентичность нуклеиновых кислот с последовательностями нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 21, 23, 25 и 27.
11. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что каждая из нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу, ацетолактатдекарбоксилазу и NADH-оксидазу, находится под контролем промотора, идентичного или отличающегося, причем указанные промоторы характеризуются последовательностью нуклеиновых кислот, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 80% идентичность нуклеиновых кислот с последовательностями нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 29-39, 49 и 50.
12. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что каждая из нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу, ацетолактатдекарбоксилазу и NADH-оксидазу, находится под контролем терминатора транскрипции, идентичного или отличающегося, причем указанные терминаторы транскрипции характеризуются последовательностью нуклеиновых кислот, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 80% идентичность нуклеиновых кислот с последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 40-48.
13. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что активность пируватдекарбоксилазы снижают при помощи разрушения по меньшей мере одного гена pdc.
14. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что когда рекомбинантные дрожжи принадлежат к роду Saccharomyces, то активность пируватдекарбоксилазы снижают при помощи разрушения по меньшей мере двух генов pdc, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из pdc1, pdc5, pdc6 и их комбинации, и более конкретно, из группы, состоящей из pdc1 и pdc6.
15. Рекомбинантные дрожжи по п. 13 или 14, отличающиеся тем, что активность пируватдекарбоксилазы снижают при введении по меньшей мере одной ДНК-конструкции(ий), выбранной из группы, включающей формулы (I)-(III), и, предпочтительно по меньшей мере одной из указанных ДНК-конструкции(ий), включающих только по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту(ы), кодирующую ALS и/или ALD.
16. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 2-14, отличающиеся тем, что ДНК-конструкция(ии), выбранная(ые) из группы, включающей формулы (I)-(III), включающие по меньшей мере ген(ы) NOXE, вставлена/вставлены в эндогенный ген URA3 указанных рекомбинантных дрожжей.
17. Применение рекомбинантных дрожжей, таких как определено по любому из пп. 1-16, для получения ацетоина и/или его производных, в частности метилвинилкетона.
18. Способ получения ацетоина, причем указанный способ включает стадии:
(а) культивирования рекомбинантных дрожжей, таких как определено по любому из пп. 1-16, в подходящей культуральной среде; и
(с) выделения ацетоина.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная культуральная среда включает источник углерода, предпочтительно выбранный из группы, включающей глюкозу и сахарозу.
