Способ культивирования одиночной в-клетки - RU2015155197A
Код документа: RU2015155197A
Формула
1. Способ получения B-клетки, включающий следующие этапы:
а) получение B-клеток из крови кролика,
б) мечение IgG+-B-клеток, и/или CD138+-B-клеток,
в) инкубация В-клеток при температуре 37°C в течение одного часа в среде для совместного культивирования перед размещением меченых B-клеток в виде одиночных клеток,
г) культивирование размещенных по отдельности клеток вместе с фидерными клетками в среде для совместного культивирования,
д) выбор B-клетки, пролиферирующей на этапе г) и, тем самым, получение B-клетки.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что способ включает этап центрифугирования клеток, размещенных в виде одиночных клеток, перед совместным культивированием.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что способ включает непосредственно перед этапом мечения следующий этап: аб) пэннинг B-клеток с иммобилизованным антигеном.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что совместное культивирование осуществляют в полистироловых многолуночных планшетах, покрытых неволокнистым субстратом, изготовленным из смеси полимерной пластической смолы и амфипатических молекул.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что B-клетки получают центрифугированием в градиенте плотности.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фидерные клетки являются мышиными клетками EL-4 B5.
7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что среда для совместного культивирования содержит фидерную смесь.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанная фидерная смесь представляет собой культуральный супернатант тимоцитов.
9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанная фидерная смесь содержит интерлейкин-1 бета и фактор некроза опухоли альфа, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из интерлейкина-2, интерлейкина-10, клеток золотистого стафилококка штамма Cowan, интерлейкина-21, B-клеточного фактора активации из семейства фактора некроза опухоли (BAFF), интерлейкина-6, интерлейкина-4, 5-(4-феноксибутокси)псоралена и других стимулирующих компонентов, увеличивающих способность B-клеточного клона к продукции IgG, не уменьшая число IgG+-клеток.
10. Способ получения антитела, включающий следующие этапы, при которых:
а) берут популяцию зрелых В-клеток, полученную из крови кролика,
б) осуществляют мечение IgG+-B-клеток, и/или CD138+-B-клеток по меньшей мере одной флуоресцентной меткой,
в) инкубируют B-клетки при температуре 37°C в течение одного часа в среде для совместного культивирования перед размещением одиночных клеток из популяции меченых B-клеток в отдельные контейнеры,
г) культивируют размещенные по отдельности В-клетки в присутствии фидерных клеток и фидерной смеси,
д) определяют специфичность связывания антител, секретируемых в среду для культивирования отдельных В-клеток,
е) определяют аминокислотную последовательность вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител путем ПЦР с обратной транскрипцией и путем секвенирования нуклеотидов, тем самым получая нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела,
ж) вводят нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,
з) вводят нуклеиновую кислоту в клетку,
и) культивируют клетку и выделяют антитело из клетки или клеточного культурального супернатанта, тем самым получая антитело.
