Офтальмические композиции и способы лечения глаз - RU2410081C2

Код документа: RU2410081C2

Чертежи

Показать все 8 чертежа(ей)

Описание

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к офтальмическим композициям и способам, пригодным для лечения глаз. В частности, данное изобретение относится к офтальмическим композициям, включающим смеси компонентов, которые эффективно обеспечивают желаемую защиту поверхности глаза человека или животных, а также к способам лечения глаз человека или животных с применением офтальмических композиций, например данных офтальмических композиций.

Глаза млекопитающих, таких как человек или другие млекопитающие (животные), преимущественно имеют соответствующую смазку, обеспечивающую комфорт и создающую условия для хорошего и четкого зрения. Обычно такая смазка создается естественным образом за счет слезной пленки, которая образуется на наружной, открытой поверхности глаза. Эта слезная пленка представляет собой сложную жидкость, которая постоянно восполняется естественным образом благодаря слезным, мейбомиевым и другим железам и в норме обеспечивает необходимое увлажнение и питание поверхности глаза. Кроме покрытия и защиты нежной поверхности глаза, зона контакта слезной пленки с воздухом также выполняет функцию поверхности первичного преломления. Однако во многих случаях эта слезная пленка может быть представлена в недостаточном количестве, и тогда возникает состояние, известное как «сухой кератит».

Для лечения сухого кератита было предложено довольно большое количество лекарств. Применяли, например, искусственные слезы, которые представляют собой химические композиции, функциональные свойства которых воспроизводят или имеют сходство с функциональными свойствами естественных слез. Во многих случаях такие искусственные слезы приходится применять очень часто, так как они быстро исчезают с поверхности глаза. Более того, несмотря на то что искусственные слезы увлажняют глаза, они не обеспечивают достаточной смазки глазной поверхности. Были предложены композиции, содержащие специальные смазывающие вещества. Например, для обработки глаз применяли различные композиции, содержащие соединения карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ).

В норме поверхность глаза человека и животного омывается слезами нормальной осмотической силы, в основном изотоническими. Если осмотическая сила возрастает, клетки глазной поверхности оказываются в гиперосмотической или гипертонической среде, что вызывает неблагоприятное уменьшение объема клеток вследствие трансэпителиальной потери воды, а также другие нежелательные последствия. Компенсаторные механизмы ограничены во многих отношениях, что приводит к нарушениям глазной поверхности и вызывает дискомфорт. Например, клетки могут пытаться уравновесить осмотическое давление за счет увеличения внутриклеточной концентрации электролитов. Однако при высокой концентрации электролитов метаболизм клетки во многом меняется, включая снижение активности ферментов и повреждение мембраны. К тому же, было показано, что гипертоническая среда способствует воспалению глазной поверхности.

Клетки различных форм жизни способны компенсировать гипертоническое воздействие за счет естественной аккумуляции или синтеза так называемых «совместимых растворимых веществ», которые выполняют функции электролитов, уравновешивая осмотическое давление, и при этом не влияют, в отличие от электролитов, на клеточный метаболизм. Совместимые растворимые вещества или совместимые растворимые агенты обычно не заряженные и могут удерживаться в живой клетке, например в клетке глаза, имеют сравнительно небольшую молекулярную массу и совместимы с клеточным метаболизмом в других отношениях. Совместимые растворимые вещества также считаются осмопротекторами, так как они могут обеспечивать протекание клеточного метаболизма и/или способствовать выживанию клеток в гиперосмотических условиях, жизнь которых в противном случае была бы ограничена.

К примеру, существует группа организмов, называемых галофилами, которые населяют гипергалинные среды, такие как соленые озера, глубокие морские бассейны и искусственно созданные испарительные бассейны. Эти организмы могут быть как про-, так и эукариотами и могут обладать механизмами синтеза и/или аккумуляции множества совместимых растворимых агентов, включая многоатомные спирты, сахара, аминокислоты и их производные, такие как глицин, бетаин, пролин, эктоин и т.п.

Глицерин (глицерол) является широко применяемым осмотическим агентом, в отношении которого показано, что он является совместимым растворимым веществом во множестве типов клеток большого количества видов. Также о нем известно, что он является увлажнителем и глазной смазкой. В США глицерин наносят местно на поверхность глаза для снятия раздражения в концентрации вплоть до 1%, а также его применяли в более высоких концентрациях для создания осмотического давления в безрецептурных препаратах. Учитывая его маленький размер и биологическое происхождение, глицерин должен легко проходить через клеточные мембраны, а в некоторых типах клеток были недавно найдены транспортные каналы, облегчающие транспорт глицерина.

Хотя глицерин может сам по себе выступать в качестве совместимого растворимого вещества, он может быть излишне подвижным, то есть он может проходить сквозь мембраны слишком свободно, в большей степени, чем это нужно для того, чтобы обеспечить длительный положительный эффект в конкретных системах. Например, естественная слезная пленка глаза человека содержит очень небольшое количество глицерина. В случае местного введения препарата проникновение в клетки происходит, вероятно, весьма быстро. Однако так как его концентрация в слезной жидкости падает, возможно, глицерин теряется клетками и выходит в слезную жидкость, что ограничивает продолжительность положительного эффекта.

Другой важный класс соединений, обладающих осмопротекторными свойствами во множестве тканей - это определенные аминокислоты. В частности, было показано, что бетаин (триметилглицин) активно сорбируется клетками почек в ответ на изменения осмотического давления, а таурин накапливается в клетках глаза в условиях гипертонии.

Существует необходимость создания офтальмической композиции, например искусственных слез, глазных капель и т.п., совместимой с поверхностью глаза человека или животного и способствующей эффективному перенесению глазной поверхностью гипертонических условий.

Гипотонические композиции применяли при лечении глаз в качестве способа борьбы с эффектами гипертонических условий. Такие композиции эффективно смачивают глазную поверхность водой, которая быстро проникает в клетки, когда ее вводят в виде гипотонической искусственной слезы. Однако вследствие высокой подвижности воды в клетках и вне клеток такой эффект будет весьма кратковременным. Кроме того, было показано, что при перенесении клеток из гипертонических условий в изотонические или гипотонические угнетаются транспортные механизмы клетки, направленные на аккумуляцию совместимых растворенных веществ. Таким образом, прменение гипотонических искусственных слез снижает способность клетки противостоять гипертонии, которая снова наступает вскоре после применения капель.

Данные клинических наблюдений, что такие агенты, как натриевая карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) и гиалуронат натрия (ГН), пригодны для лечения симптомов сухого кератита или глазных заболеваний, являются общепризнанными. Также было показано, что два этих полианионных агента особенно пригодны в тех условиях, когда происходит повреждение роговицы (КМЦ при хирургической процедуре LASIK (laser assisted in situ ceratomileusis - лазерный кератомилез in situ) и аллергическом инсульте роговицы (ГН и язвы при аллергии)).

Кроме того, предполагается, что слезная пленка здорового глаза человека или животного может иметь повышенный (детектируемый) уровень главного белка со свойствами основания (ГБО), в то время как ранее предполагали, что данный белок экспрессируется только в условиях аллергии, сопровождающейся вовлечением в реакцию эозинофилов (поздняя фаза аллергии). В настоящее время известно, что ГБО вырабатывается тучными клетками (ТК), а также эозинофилами, которые обычно ассоциированы с тканями слизистой глаза и дегранулируют с высвобождением ГБО и других катионных соединений в случае антигенной стимуляции, механических повреждений и прочих воздействий.

Другая группа катионных белков, функционирующих на поверхности глаза, представляет собой один или несколько дефенсинов, которые являются составной частью естественной системы антимикробной защиты организма. В слезной пленке пациентов с сухим кератитом обнаруживается повышенный уровень дефенсинов, которые оказывают неблагоприятное воздействие на состояние глазной поверхности непосредственно или в результате взаимодействия с другими соединениями.

Существуют признанные виды лечения, разработанные с целью снижения вероятности дегенерации тучных клеток, причем большинство этих видов лечения применяют в отношении поверхности глаза в сочетании с лечением сезонного или хронического аллергического конъюнктивита. Однако для случая, когда дегрануляция уже произошла, не существует известных способов сорбции, очищения и инактивации высвобожденных катионных медиаторов, включая ГБО. Увлажнение с помощью солевых растворов способно снизить концентрацию таких агентов, но в большинстве случаев является нецелесообразным. Также недавние данные свидетельствуют в пользу того, что ГБО присутствует на глазной поверхности в детектируемой концентрации даже в случае, когда аллергия не наблюдается, а это значит, что избыток ГБО и возможное незначительное повреждение глазной поверхности могут произойти у индивидов в любой конкретный момент.

Было бы выгодно разработать офтальмические композиции, эффективно предотвращающие или снижающие неблагоприятное воздействие катионных, например поликатионных, веществ на поверхность глаза человека или животного.

Краткое описание изобретения

Были открыты новые офтальмические композиции для лечения глаз, а также способы лечения глаз. Настоящие композиции очень эффективно лечат глаза, например глаза, подверженные или восприимчивые к таким заболеваниям/условиям, как, не ограничиваясь этими примерами, сухой кератит, среда с пониженной влажностью, стресс/травма, например, вследствие хирургических процедур и т.д. В частности, такие композиции могут быть эффективны для смягчения повреждающих эффектов гипертонической слезной пленки независимо от причин. Данные композиции относительно эффективны, их изготовление несложно и недорого, а их применение, например местное применение на глазной поверхности, очень удобно.

В одном широком аспекте изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие компонент-носитель, предпочтительно водный носитель, и эффективное количество тонического компонента, включая вещество, выбранное из совместимых растворимых компонентов, например один или более конкретных совместимых растворимых агентов, и их смесь. В одном особенно предпочтительном воплощении тонический компонент включает вещество, выбранное из группы соединений эритрита и их смеси. В одном дополнительном воплощении тонический компонент содержит соединения, выбранные из комбинаций как минимум двух различных совместимых растворимых агентов.

В другом широком аспекте изобретения предложены офтальмические композиции, содержащие вещество-носитель, например, на водной основе и эффективное количество вещества, выбранного из таких компонентов, как инозит, ксилол и их смесь. Осмолярность таких соединений обычно выше или больше изотонической, например в диапазоне от минимум 310 до приблизительно 600 или до приблизительно 1000 мОсмоль/кг.

В другом широком аспекте изобретения предложены офтальмические композиции, содержащие вещество-носитель, например, на водной основе и эффективное количество вещества, выбранного из соединений карнитина и их смеси. В особенно предпочтительно воплощении композиция имеет неизотоническую осмолярность.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложены офтальмические композиции, содержащие вещество-носитель, например, на водной основе и эффективное количество тонического компонента, содержащего вещество, выбранное из смеси или комбинации совместимых агентов, например, выбранных из смесей одного или более компонентов, представляющих собой многоатомные спирты, и/или одного или более компонентов, представляющих собой аминокислоты.

В каждом из упомянутых выше аспектов изобретения данные композиции предпочтительно имеют такой химический состав, чтобы вещество или смесь органических совместимых растворимых веществ, входящих в состав тонического компонента, была эффективной при применении композиции для лечения глаз, позволяя глазной поверхности переносить гипертонические условия на поверхности глаза более эффективно по сравнению с аналогичными композициями, не содержащими такое вещество или смесь органических совместимых растворимых агентов.

В еще одном широком аспекте изобретения предложены офтальмические композиции, содержащие компонент-носитель, компонент, придающий тоничность, и полианионный компонент. Тонический компонент присутствует в количестве, достаточном для придания композиции желаемой осмолярности, и содержит совместимый растворимый компонент. Полианионный компонент в случае, когда композицию применяют для лечения глаз человека или животного, присутствует в количестве, достаточном для уменьшения как минимум одного неблагоприятного эффекта, оказываемого на поверхность глаза человека или животного катионным, например поликатионным, соединением, по сравнению с аналогичными композициями, не содержащими полианионного компонента. Катионные соединения могут иметь различное происхождение, например, могут быть эндогенными, привнесенными из окружающей среды или появиться как нежелательное последствие применения в глазу какого-либо агента, например раствора для хранения или другого продукта для ухода за контактными линзами. В одном особенно предпочтительном воплощении гиалуроновая кислота не является единственным полианионным компонентом. Другие полианионные компоненты больше подходят для использования в составе данной композиции, например больше подходят для местного применения на глазной поверхности человека или животного, чем гиалуроновая кислота или ее соли. В другом воплощении данного изобретения композиция имеет осмолярность в пределах от приблизительно 300 до приблизительно 600 или приблизительно 1000 мОсмоль/кг.

В другом аспекте изобретения предложены офтальмические композиции, содержащие компонент-носитель и полианионный компонент, выбранный из полианионных пептидов, аналогов полианионных пептидов, фрагментов аналогов полианионных пептидов, карбоксиметил замещенных полимерных сахаров, включая, но не ограничиваясь этим примером, глюкозу и ей подобные сахара, а также их смеси. Такие полианионные компоненты в случае, когда композицию применяют для лечения глаз человека или животного, присутствуют в количестве, достаточном для снижения как минимум одного неблагоприятного эффекта, оказываемого на поверхность глаза человека или животного катионным, например поликатионным, соединением/веществом, по сравнению с аналогичными композициями, не содержащими полианионного компонента.

Также предложены способы лечения глаз человека или животных. Такие способы включают введение композиции, например композиции, соответствующей данному изобретению, в глаз человека или животного с целью достижения не менее одного положительного эффекта для глаз.

Любой и все описываемые признаки, а также комбинации этих признаков включены в область данного изобретения при условии, что признаки любой такой комбинации не являются взаимоисключающими.

Эти и другие аспекты данного изобретения детально описаны в последующем подробном описании, сопровождаемом чертежами, примерами и формулой изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой графическое отображение интенсивности по отношению к фосфорилированым c-jun N-концевым киназам (p-JNK1 и p-JNK2, JNK - jun N-terminus kinase, N-концевая киназа jun) для конкретных офтальмических композиций.

Фиг.2 представляет собой графическое отображение интенсивности по отношению к p-JNK1 и p-JNK2 для других конкретных офтальмических композиций.

Фиг.3 представляет собой графическое отображение отношения фосфорилированной JNK к общему количеству JNK для конкретных офтальмических композиций, определенного с помощью способа Биадлита (Beadlyte).

Фиг.4 представляет собой графическое отображение отношения фосфорилированной р38 MAP киназы (MAP - mitogen activated protein, активируемый митогенами белок) к общему количеству р38 MAP киназы для конкретных офтальмических композиций, определенного с помощью способа Beadlyte.

Фиг.5 представляет собой графическое отображение отношения фосфорилированной ERK MAP киназы к общему количеству ERK MAP киназы для конкретных офтальмических композиций, определенного с помощью способа Beadlyte.

Фиг.6 представляет собой графическое отображение суммы зависимых от концентрации воздействий на трансэпителиальную электрическую резистентность (ТЭЭР) для различных офтальмических композиций.

Фиг.7 представляет собой графическое отображение влияния на ТЭЭР других различных офтальмических композиций, включая композиции, содержащие комбинации совместимых растворимых агентов.

Фиг.8 представляет собой графическое отображение влияния на ТЭЭР других различных офтальмических композиций, включая композиции, содержащие комбинации совместимых растворимых агентов.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение имеет отношение к офтальмическим композициям, пригодным для лечения глаз человека или животных. Как отмечалось выше, в одном аспекте изобретения предложены композиции, содержащие компонент-носитель, например, на водной основе или водный компонент-носитель, а также компонент, придающий тоничность, который включает вещество, выбранное из минимум одного совместимого растворимого вещества, например органического совместимого растворимого вещества. Такие композиции преимущественно содержат эффективное количество вещества, достаточное для того, чтобы при введении композиции в глаз вещество эффективно обеспечивало глазной поверхности возможность лучше переносить гипертонические условия, по сравнению с идентичной композицией, не содержащей такого вещества.

Хотя такие композиции могут иметь любую требуемую тоничность или осмолярность, например гипотоническую осмолярность, по существу изотоническую осмолярность или же гипертоническую осмолярность, особенно предпочтительные композиции имеют осмолярность, отличную от изотонической, например большую, чем изотоническая. В одном воплощении такие композиции имеют осмолярность в диапазоне от не менее приблизительно 300-310 до приблизительно 600-1000 мОсмоль/кг.

Многоатомные спирты, такие как компоненты, представляющие собой эритрит, ксилит, инозит, и аналогичные вещества, а также их смеси являются эффективными тоническими/осмотическими агентами и могут входить сами по себе или в сочетании с глицерином и/или другими совместимыми растворимыми агентами в состав данных композиций. Без ограничения объема изобретения каким-либо определенным принципом полагается, что поскольку многоатомные спирты имеют больший по сравнению с молекулой глицерина размер, такие компоненты - многоатомные спирты - при местном применении для лечения глаз накапливаются в клетках медленнее, чем глицерин, однако остаются внутри клеток в течение более длительного срока по сравнению с глицерином.

В одном особенно предпочтительном воплощении смеси двух или нескольких различных совместимых растворимых компонентов, например глицерина, и/или одного или нескольких компонентов - многоатомных спиртов, и/или одного или нескольких других совместимых растворимых компонентов, например одного или нескольких незаряженных или цвиттер-ионных аминокислотных компонентов и подобных им соединений, можно успешно применять вместе, обеспечивая один или несколько положительных эффектов, которые не достигаются при применении композиций, включающих только один совместимый растворимый компонент.

Термин «компонент», используемый здесь по отношении к конкретному соединению, относится к самому этому соединению, его изомерам и стереоизомерам, если таковые имеют место, к его приемлемым солям, производным соединениям и тому подобному, а также к их смесям.

Термин «производное», используемый здесь, если он относится к конкретному соединению, относится к соединению, имеющему химическое строение или структуру, достаточно схожую с данным соединением таким образом, что оно может функционировать очень сходным или таким же образом, что и данное соединение, в настоящих композициях и/или способах.

При разработке составов данных композиций можно учитывать комфорт и переносимость. Количество органических совместимых растворимых компонентов, используемых в настоящих композициях, должно эффективно обеспечивать минимум один положительный эффект для глаз пациента, не оказывая при этом на пациента нежелательного неблагоприятного воздействия, например не вызывая дискомфорта, рефлекторного слезотечения и подобных неблагоприятных эффектов.

Разработчик рецептур, являющийся специалистом в данной области, способен разработать густые жидкости и гели, которые остаются на глазной поверхности в течение более длительного периода, чем менее густые жидкости, однако при этом часто вызывают в качестве побочного эффекта временное помутнение зрения. Густые жидкости и гели, тем не менее, имеют то преимущество, что для доставки нужного количества вещества их можно наносить менее часто.

В случае использования только ксилита или эритрита может потребоваться более продолжительное время контакта для обеспечения их эффективности в качестве совместимых растворимых компонентов, например, в зависимости времени, необходимого для поглощения их клетками. Однако при попадании на место, например в клетки поверхности глаза, положительный эффект от уравновешивания гипертонических условий будет благоприятно более длительным, чем при применении эквивалентного количества глицерина, который быстро проникает в клетки и из клеток. Такой продолжительный положительный эффект в сочетании с менее частым применением препарата может быть достигнут без затуманивания зрения.

В одном воплощении настоящие композиции включают комбинацию или смесь совместимых растворимых агентов, причем все агенты относятся предпочтительно к различным типам химических веществ и/или имеют различный молекулярный размер и/или подвижность. Маленькие и подвижные агенты дают быстрый, но кратковременный эффект, например защиту от гипертонического инсульта, в то время как большие и менее подвижные агенты обеспечивают замедленное, однако более продолжительное защитное действие.

И ксилит, и эритрит, и глицерин имеют высокую концентрацию гидроксильных групп: одна группа на атом углерода. Гидроксильные группы обеспечивают лучшее связывание воды и увеличивают растворимость соединения. Для композиций, применяемых при лечении сухого кератита, высокая концентрация гидроксильных групп может увеличивать эффективность композиции за счет предотвращения потери воды тканями.

Среди многоатомных спиртов для глазного использования предпочтительны 5-углеродный ксилит, 4-углеродный эритрит и 3-углеродный глицерин. 2-Углеродная форма (этиленгликоль) является хорошо известным ядом и непригодна для использования. 6-Углеродные формы (маннит, сорбит и соответствующие деоксисоединения) можно использовать в сочетании с более мелкими молекулами. В одном воплощении данного изобретения можно использовать комбинации многоатомных спиртов, имеющих в составе 3-6 атомов углерода, деоксипроизводные 1 или 2 атомов углерода, включая, без ограничения этими примерами, изомеры, стереоизомеры и им подобные, в зависимости от того, что является пригодным.

В соответствии с настоящим изобретением в качестве органических совместимых растворимых компонентов можно использовать незаряженные или цвиттер-ионные аминокислоты.

Соединения карнитина, например сам карнитин, его изомеры/стереоизомеры, соли, производные и аналогичные вещества и их смеси, являются совместимыми растворимыми компонентами, в высокой степени пригодными для применения в данных офтальмических композициях. Карнитин широко известен как соединение, необходимое на различных этапах метаболизма жирных кислот, таким образом, он играет существенную роль в метаболизме печени и мышечных клеток. Карнитин может служить источником энергии для множества типов клеток, включая клетки глаза. Карнитиновые компоненты могут иметь уникальные свойства и обладать большим количеством функций, например выступать в качестве осмопротекторов, участвовать в метаболизме жирных кислот, выступать в качестве антиоксидантов, способствовать заживлению раны, выступать в качестве шаперонов, а также участвовать в нейропротекции.

Органический совместимый растворимый компонент в настоящих композициях предпочтительно может быть получен при использовании комбинации агентов или веществ, имеющих различные размеры, подвижность и механизмы действия. Подвижные агенты небольшого размера, такие как небольшие многоатомные спирты, должны обеспечивать быструю, но непродолжительную осмопротекцию. Некоторые аминокислоты и родственные им соединения могут функционировать как продолжительно действующие внутриклеточные совместимые растворимые вещества и стабилизаторы белков. Согласно настоящему изобретению карнитиновые компоненты можно использовать сами по себе или в сочетании с одним или более аминоорганическим совместимыми растворимыми компонентами и/или многоатомными спиртами, например, такими как описанные здесь.

Аминосодержащие органические совместимые растворимые компоненты и/или компоненты, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются указанным, бетаин, таурин, карнитин, саркозин, пролин, триметиламины в целом, другие цвиттер-ионные аминокислоты и подобные им соединения или их смеси. Многоатомные спирты, которые можно применять в комбинации с карнитином и/или одним из ряда других аминосодержащих органических совместимых растворимых компонентов, включают, но не ограничиваются указанным, глицерин, пропилен гликоль, эритрит, ксилит, мио-инозит, манит, сорбит и им подобные вещества и их смеси.

Количество совместимых растворимых компонентов, входящих в состав данных композиций, может быть любой подходящей величиной. Однако предпочтительно такое количество эффективно обеспечивает положительный эффект при лечении глаз при введении композиции, содержащей совместимый растворимый компонент. Следует избегать появления избытка совместимых растворимых компонентов, поскольку это может доставить пациенту дискомфорт и/или причинить вред глазу во время лечения. Совместимый растворимый компонент преимущественно присутствует в количестве, достаточном для обеспечения желаемой осмолярности композиции.

Конкретное количество используемого совместимого растворимого компонента может варьироваться в широком диапазоне в зависимости от, например, общего химического состава и планируемого применения композиции, от требуемой осмолярности композиции, от использования специфического совместимого растворимого агента или комбинации таких агентов и от подобных других факторов. В одном воплощении общее количество совместимого растворимого компонента, содержащегося в данных композициях, может колебаться в пределах от приблизительно 0,01% (вес/объем) или приблизительно 0,05% (вес/объем) до приблизительно 1% (вес/объем), или приблизительно 2% (вес/объем), или приблизительно 3% (вес/объем) и более.

Клетки поверхности роговицы отвечают на осмотические изменения путем регуляции транспорта воды и солей с целью поддержания постоянного клеточного объема. В условиях хронической гипертонии, например в таких, которые наблюдаются при сухом кератите, активизируются транспортные механизмы, направленные на поглощение совместимых растворимых веществ, включая различные аминокислоты и многоатомные спирты. В одном воплощении настоящего изобретения офтальмические композиции, например искусственные слезы, содержащие совместимые растворимые компоненты, составлены таким образом, что они имеют тоничность выше или сверх изотонической и преимущественно имеют осмолярность в пределах от приблизительно 300 или приблизительно 310 до приблизительно 600 или приблизительно 1000 мОсмоль/кг. Не желая ограничивать изобретение каким-либо определенным принципом выполнения, мы предполагаем, что при таких условиях в клетках запускаются механизмы аккумуляции совместимых растворимых веществ как немедленного, так и продолжительного действия, что обеспечивает их усиленное поглощение и удержание клеткой по сравнению с изотоническими или гипотоническими условиями. Как только в клетке накапливается совместимый растворимый компонент, клетка получает усиленную защиту от возможного гипертонического инсульта, например, вызванного сухим кератитом и/или одним или другими состояниями/заболеваниями. Результатами такой усиленной защиты являются улучшение клеточного метаболизма и выживание клетки в течение часов или дней после применения офтальмической композиции по изобретению.

В нормальной слезной системе выработка слез, отток слезной жидкости и ее испарение сбалансированы, что обеспечивает увлажнение и смазку глазной поверхности. Типичные показатели осмолярности слез варьируются в пределах от 290 до 310 мОсмоль/кг у здоровых индивидуумов, и этот показатель может меняться в течение дня в ответ на изменения условий среды. У здорового индивида нервная обратная связь между глазной поверхностью и слезными железами контролирует выработку слез, что поддерживает стабильный ток жидкости на поверхности глаза. Было выдвинуто предположение, что тоничность слезной пленки является одним из основных стимулов в этой регуляторной петле обратной связи. При сухом кератите дисфункция аппарата, осуществляющего выработку (различные железы), системы оттока, нейрональных механизмов сигналинга или самой глазной поверхности приводят к неполноценности слезной пленки, повреждению глазной поверхности и дискомфорту.

На клеточном уровне сухой кератит, как правило, характеризуется хронической гипретоничностью внеклеточной среды (слезной пленки). Опубликованные данные об осмолярности слезной пленки у пациентов с сухим кератитом приводят диапазон от 300 до 500 мОсмоль/кг, при этом большинство значений лежит между 320 и 500 мОсмоль/кг. В таких условиях клетки будут терять воду и/или накапливать соли, может произойти изменение объема клеток. Было показано, что гипертония изменяет процессы клеточного метаболизма, угнетает ферментативные процессы и приводит к апоптозу и клеточной гибели.

Было показано, что в целях защиты против гипертонических изменений клетки роговицы глаза активизируют механизмы транспорта неионогенных растворимых веществ, таких как аминокислоты и полиолы, и накапливают растворенные вещества внутри клеток с целью поддержания объема клеток при неизменном балансе электролитов. В таких условиях клеточный метаболизм нарушается в меньшей степени, чем в случае изменения объема или концентрации электролитов, и такие соединения относятся к совместимым растворимым веществам. Совместимые растворимые вещества включают, но не ограничиваются, аминокислоты бетаин (триметилглицин), таурин, глицин и пролин, а также полиолы глицерин, эритрит, ксилит, сорбит и маннит. Совместимые растворимые вещества также считаются осмопротекторами, так как они поддерживают метаболизм клетки и способствуют клеточному выживанию в таких условиях гипертонии, которые сами по себе приводят к ограничению жизнедеятельности клеток.

Клетки накапливают определенные совместимые растворимые вещества путем биосинтеза внутри клетки, а другие - путем усиленного трансмембранного транспорта из внеклеточной жидкости (в данном случае из слезной пленки). В обоих случаях в процесс вовлекаются специфические синтетические белки или транспортные белки. Экспериментальные данные показывают, что эти белки активируются в условиях гипертонии, а также процессы транскрипции и трансляции данных белков стимулируются гипертонией.

Напротив, экспериментальные данные показывают, что клетки роговицы и другие клетки будут терять совместимые растворимые вещества в условиях гипотонии или при переходе от гипертонических условий к изотоническим.

При сухом кератите клетки поверхности роговицы находятся в гипертонических условиях и стимулируются к аккумулированию веществ-осмопротекторов, если таковые доступны. Добавление к глазной поверхности изо- или гипотонических искусственных слез снимает симптомы благодаря усиленному увлажнению, однако угнетает механизмы накопления осмопротекторов в этих клетках. Это может в дальнейшем спровоцировать осмотический инсульт спустя минуты или часы после употребления капель, когда слезная пленка снова станет гипертонической и подсушенной.

Согласно современным предписаниям FDA «глазной раствор должен быть осмотически эквивалентным раствору с концентрацией хлорида натрия от 0.8 до 1.0 процентов для того, чтобы соответствовать названию «изотонический раствор». Это соответствует диапазону от 274 до 342 мОсм/кг. Далее FDA постулирует, что «глазные растворы от 2 до 5% натрия хлорида являются гипертоническими и могут быть лекарствами безрецептурного отпуска в том случае, если имеют маркировку «гипертонические растворы». Этот диапазон соответствует интервалу от 684 до 1711 мОсм/кг. Согласно целям данного изобретения «супратонический» раствор должен иметь осмолярность в пределах между этими двумя интервалами, или приблизительно от 300 или 310 до приблизительно 600, или приблизительно 800, или приблизительно 1000 мОсмоль/кг, что соответствует раствору хлорида натрия с процентной концентрацией от приблизительно 0.9 до приблизительно 1.8 (1.8% - это максимальная концентрация, которую может иметь офтальмический раствор для местного применения, не маркированный как «гипертонический», согласно предписаниям FDA).

Данное изобретение принимает эти предписания к сведению при составлении супратонических искусственных слез, более совместимых с гипертоническим состоянием глаз при сухом кератите. Помимо того что данные композиции составлены как гипертонические (имеют общую осмолярность в пределах от приблизительно 300 или приблизительно 310 до приблизительно 600 или приблизительно 1000 мОсмоль/кг), они также содержат одно или несколько органических совместимых растворимых агентов согласно приведенному описанию. Супратоничность в сочетании с включением одного или нескольких совместимых растворимых веществ служит в данных композициях как для стимуляции или поддержания поглощения этих защитных веществ клетками поверхности роговицы, так и для обеспечения надежного источника таких веществ или соединений.

Помимо достаточных количеств совместимых растворимых веществ в супратонической среде, данные композиции также могут содержать соответствующее количество успокоительных и смягчающих агентов, которые обеспечат комфорт и достаточную смазку, а также преимущественно могут обеспечивать более эффективное удержание органической совместимой растворимой композиции на поверхности глаза в течение достаточного времени с целью усиления его поглощения клетками поверхности роговицы.

Следует отметить, что в предписаниях FDA четко оговаривается, что итоговая осмолярность раствора может определяться как его неионогенными, так и ионными компонентами. Таким образом, состав может содержать значительные количества глицерина и других совместимых растворимых веществ и не содержать существенных количеств каких-либо ионных тонических веществ, таких как натриевые соли. В одном воплощении данные смеси практически не содержат ионных тонических агентов.

Преимущественно данные композиции содержат комбинацию различных органических совместимых растворимых агентов, эффективно поглощаемых клетками роговицы в течение периода обработки в процессе использования капель, например от приблизительно 5 до приблизительно 30 минут в зависимости от их вязкости, после применения и удерживаемых внутри клеток в течение временного интервала длиной в несколько часов между применениями капель.

Благодаря усиленной защите от осмотического инсульта, обеспечиваемой данной композицией, продолжительность клинического эффекта, вызываемого каждой дозировкой или применением препарата, увеличена. С помощью регулярного применения данных композиций обеспечивается благоприятное состояние клеток поверхности глаза, так, в меньшей степени нарушается клеточный метаболизм и стимулируется выживание клеток.

В соответствии с другим аспектом данного изобретения разработаны композиции, содержащие компонент-носитель и полианионный компонент. Такие композиции, содержащие полианионный компонент, преимущественно, хотя и необязательно в случае некоторых воплощений, включают органические совместимые растворимые компоненты согласно приведенному описанию.

В одном воплощении разработаны композиции, содержащие компонент-носитель и полианионный компонент в количестве, достаточном для лечения глазной поверхности в условиях повышенного содержания катионных элементов, например, но не ограничиваясь этим примером, повышенного содержания Главного Основного Белка (ГОБ), и/или пониженной концентрации полианионных соединений на глазной поверхности. В одном воплощении данные офтальмические композиции содержат полианионные соединения в количестве, которое эффективно снижает как минимум одно неблагоприятное воздействие катионных, например поликатионных, соединений на глазную поверхность по сравнению с аналогичными композициями, не содержащими полианионного компонента, при введении композиций в глаз человека или животных.

В одном из воплощений композиции, содержащие полианионные компоненты, например включающие или нет совместимые растворимые компоненты, могут быть эффективно использованы перед, во время и/или после проведения хирургических процедур, включая, но не ограничиваясь, хирургические процедуры, в процессе которых глаз подвергается воздействию лазера, например при лечении пятен, сухости и других осложнений поверхности глаза после процедуры LASIK. Этиология нарушений глазной поверхности после процедуры LASIK может быть многофакторной, включая, но не ограничиваясь, вызванную хирургическим вмешательством нейротрофическую гипертензию и кератит, повреждение лимбических клеток, нарушение смыкания век вследствие изменения топографии роговицы, химические повреждения глазной поверхности лекарствами местного применения, консервантами и аналогичными веществами.

Введение композиций, содержащих полианионные компоненты, в соответствии с данным изобретением на глазную поверхность и слезную пленку может быть эффективным при лечении одного из, а возможно, больше чем одного или даже всех упомянутых выше нарушений, вызывающих повреждения глазной поверхности после процедуры LASIK.

В одном из воплощений в состав данных композиций входят полианионные компоненты, своей активностью, например антигенной и/или цитотоксической, имитирующие продомен ГОБ, который, как было показано, является полипептидом, состоящим из 90 остатков. Используемые агенты могут содержать один или более полипептидных аналогов этой последовательности или частей этой последовательности.

Согласно данному документу термин «имитирующие» означает, что полианионные компоненты, например полипептидные аналоги, имеют активность в пределах (плюс или минус) от приблизительно 5% до приблизительно 10%, или приблизительно 15%, или приблизительно 20% от соответствующей активности продомена ГОБ.

Продомен ГОБ имеет аминокислотную последовательность, представленную ниже SEQ ID NO:1

Полипептидный аналог последовательности продомена Главного Основного Белка или части последовательности продомена Главного Основного Белка означает пептид, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную как минимум на приблизительно 75%, или приблизительно на 80%, или приблизительно на 85%, или приблизительно на 90%, или приблизительно на 95%, или приблизительно на 99%, или более гомологичной последовательности аминокислот, представленной SEQ ID NO:1, или ее части.

Карбоксиметилзамещенные полимеры сахаров, например, но не ограничиваясь, глюкоза и аналогичные сахара, могут быть использованы как полианионные компоненты в соответствии с данным изобретением.

Далее используемые дополнительно полианионные компоненты включают, но не ограничиваются, модифицированные углеводы, другие полианионные полимеры, например, но не ограничиваясь, полимеры, уже доступные для использования в фармпрепаратах и их смесях. Можно использовать смеси одного или более таких описанных выше полипептидных аналогов и одного или более упомянутых выше полианионных компонентов.

Данные композиции преимущественно являются офтальмически приемлемыми, содержат офтальмически приемлемый компонент-носитель, совместимый растворимый компонент и/или полианионный компонент.

Композиция, компонент-носитель или другой компонент или соединение считаются «офтальмически приемлемыми» в случае, если они совместимы с тканями глаза, а это означает, что они не вызывают заметные или чрезмерно нежелательные эффекты при контакте с тканями глаза. Предпочтительно, офтальмически приемлемый компонент или соединение является также совместимым с другими компонентами данного изобретения.

Используемый в тексте термин «полианионный компонент» относится к химическому объекту, например, ионного, заряженного типа, такому как несущий ионный заряженный полимерный материал, который несет более чем один дискретный анионный заряд, то есть многократный дискретный анионный заряд. Предпочтительно, полианионный компонент выбирают из группы, состоящей из полимерных материалов с многократными анионными зарядами и их смесей.

Полианионный компонент может иметь по существу постоянный или неизменный молекулярный вес или может быть образован двумя или несколькими полианионными фрагментами с различными молекулярными весами. Офтальмические композиции, содержащие полианионные компоненты, включающие два или несколько фрагментов разного молекулярного веса, описываются в U.S. Patent Application Serial No. 10/017,817 от 14 декабря 2001, описание которого в общем виде включено в данный текст в виде ссылок.

Предпочтительно, композиция имеет повышенную способность приставать к поверхности глаза при введении композиции в глаз по сравнению с практически идентичной композицией, которая не содержит полианионного компонента. Учитывая упомянутое выше хорошо выраженное свойство приставать к поверхности глаза, данные композиции предпочтительно эффективно обеспечивают наличие хорошей смазки, так что не возникает необходимости повторного применения препарата в течение более длительного периода времени по сравнению с практически идентичной композицией, которая не содержит полианионного компонента.

В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любой подходящий полианионный компонент при условии, что он функционирует так, как описано данным документом, и не оказывает существенного неблагоприятного воздействия на композицию в целом или на глаз, куда вводится эта композиция. Полианионный компонент является предпочтительно офтальмически приемлемым в тех концентрациях, в которых он используется. Полианионный компонент предпочтительно несет три (3) или более анионных (или отрицательных) заряда. В том случае, когда полианионный компонент является полимерным материалом, предпочтительно, чтобы множество повторяющихся единиц, составляющих этот полимерный материал, несли дискретный анионный заряд. Особенно практичными анионными компонентами являются те, что растворимы в воде, например растворимые в концентрациях, используемых в данном изобретении при комнатной температуре.

Примерами подходящих полианионных компонентов, которые могут быть использованы в данных композициях, могут быть, не ограничиваясь этими примерами, анионные производные целлюлозы, анионные кислотосодержащие полимеры акрила, анионные кислотосодержащие полимеры метакрилина, анионные полимеры, содержащие аминокислоты, а также их смеси. Анионные производные целлюлозы можно легко использовать в данном изобретении.

К особенно благоприятному для использования классу полианионных компонентов относятся один или несколько видов полимерных материалов, несущих множество анионных зарядов. Примеры включают, но не ограничиваются:

металкарбоксиметилцеллюлозы

металкарбоксиметилгидроксиэтилцеллюлозы

металкарбоксиметилкрахмалы

металкарбоксиметилгидроксиэтилкрахмалы

металкарбоксиметилпропилгуары

гидролизованные полиакриламиды и полиакрилонитрилы

гепарин

глюкозамингиканы

гиалуроновая кислота

хондроитин сульфат

дерматан сульфат

пептиды и полипептиды

альгиновая кислота

альгинаты металлов

гомополимеры и сополимеры одного или нескольких веществ из следующего списка:

акриловая и метакриловая кислоты

акрилаты и метакрилаты металлов

винилсульфоновая кислота

винилсульфонаты металлов

аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота и подобные соединения

металлические соли аминокислот

п-стиролсульфоновая кислота

п-стиролсульфонаты металлов

2-метакрилолооксиэтилсульфоновые кислоты

2-метакрилолооксиэтилсульфонаты металлов

3-метакрилолоокси-2-гидроксипропилсульфоновые кислоты

2-акриламидо-2-метилпропансульфоновые кислоты

2-акриламидо-2-метилпропансульфонаты металлов

аллилсульфоновая кислота

аллилсульфонаты металлов и похожие соединения.

Отличные результаты были получены при использовании полианионных компонентов, выбранных из карбоксиметилцеллюлоз и их смесей, например соединений метилцеллюлоз со щелочными и/или щелочноземельными металлами.

Данные композиции предпочтительно являются растворами, хотя могут быть использованы и другие формы, такие как мази, гели и аналогичные варианты.

Компонент-носитель является фармацевтически приемлемым и может содержать один или несколько компонентов, которые обеспечивают такую офтальмическую приемлемость, и/или улучшают характеристики композиции, и/или оказывают положительный эффект на глаз, куда вводят композицию, и/или оказывают благоприятное воздействие на пациента, глаз которого лечат.

Преимущественно компонент-носитель имеет водную основу, например содержит большое количество, то есть минимум 50% по массе, воды. Другие компоненты, которые могут быть включены в состав компонента-носителя, содержат, не ограничиваясь этим примером, буферные компоненты, компоненты-консерванты, регуляторы рН, компоненты, традиционно входящие в состав искусственных слез, и тому подобное, а также и их смеси.

Данные композиции предпочтительно обладают вязкостью, соответствующей вязкости воды. В одном воплощении вязкость данных композиций равна минимум приблизительно 10 сП (сантипуаз), более предпочтительно находится в пределах от приблизительно 10 сП до приблизительно 500 сП или приблизительно 1000 сП. Преимущественно вязкость данной композиции находится в пределах от приблизительно 15 сП, или приблизительно 30 сП, или приблизительно 70 сП до приблизительно 150 сП, или приблизительно 200 сП, или приблизительно 300 сП, или приблизительно 500 сП. Вязкость данной композиции можно измерить любым подходящим способом, например стандартным. Стандартный вискозиметр Брукфилда (Brookfield) используется для такого рода измерений вязкости.

В одном из воплощений полианионный компонент присутствует в количестве от приблизительно 0.1% до приблизительно 5%, предпочтительно от приблизительно 0.2% до приблизительно 2.5%, более предпочтительно от приблизительно 0.2% до приблизительно 1.8%, особенно предпочтительно от приблизительно 0.4% до приблизительно 1.3% (масса/объем) от композиции.

Другие компоненты, входящие в состав компонентов-носителей, включают, но не ограничиваются этим списком, буферные компоненты, тонические компоненты, консерванты, регуляторы рН, компоненты, традиционно входящие в состав искусственных слез, такие как один или несколько электролитов, подобные им вещества и их смесей. В одном из воплощений компонент-носитель содержит как минимум одно вещество из следующих: эффективное количество буферного компонента, эффективное количество тонического компонента, эффективное количество компонента-консерванта и воду.

Эти дополнительные компоненты являются предпочтительно офтальмически приемлемыми и могут быть выбраны из ряда соединений, традиционно входящих в состав офтальмических композиций, например композиций, используемых для лечения глаз, пораженных сухим кератитом, искусственных слез и подобных составов. Приемлемые эффективные концентрации таких дополнительных компонентов в композициях по изобретению уже ясны для квалифицированного практикующего фармацевта.

Компонент-носитель предпочтительно содержит эффективное количество компонента, регулирующего тоничность, для придания композиции необходимой тоничности. Компонент-носитель предпочтительно содержит буферный компонент в количестве, достаточном для поддержания рН композиции в желаемом диапазоне. Среди подходящих тонических компонентов можно использовать традиционно входящие в состав офтальмических композиций, такие как одна или несколько различных неорганических солей и похожих соединений. Хлорид натрия, хлорид калия, манит, декстроза, глицерин, пропиленгликоль и похожие соединения, а также их смеси являются очень адекватными компонентами для придания необходимой тоничности.

Среди подходящих буферных компонентов или буферных агентов, которые можно использовать, присутствуют компоненты, традиционно используемые при изготовлении офтальмических композиций. Буферные соли включают щелочные металлы, щелочноземельные металлы и/или соли аммония, а также цитраты, фосфаты, бораты, лактаты и похожие соли, а также их смеси. Можно использовать подходящие органические буферные соединения, такие как буфер Гуда (Goode) и тому подобное.

В состав данных композиций может быть включен любой подходящий компонент-консервант при условии, что он эффективен как консервант в присутствии полианионного компонента. Так, важно, чтобы на компонент-консервант не действовал существенно полианионный компонент. Безусловно, выбор компонента-консерванта зависит от многих факторов, например от наличия специфического полианионного компонента, других компонентов, входящих в состав композиции и т.д. Примерами подходящих компонентов-консервантов могут быть, не ограничиваясь этим списком, персоли, такие как пербораты, перкарбонаты и подобные соединения; пероксиды в очень низкой концентрации, например от приблизительно 50 до приблизительно 200 ppm (масса/объем) перекиси водорода и т.п.; спирты, такие как бензиловый спирт, хлорбутанол и подобные соединения; сорбиновая кислота, ее офтальмически приемлемые соли и их смеси.

Количество компонента-консерванта, входящего в состав данной композиции, содержащей такой компонент, варьируется в достаточно широком диапазоне в зависимости от, например, специфичности используемого компонента-консерванта. Количество такого компонента предпочтительно находится в пределах от приблизительно 0.000001% до приблизительно 0.05% или более (масса/объем) в данной композиции.

Одним особенно полезным для использования классом компонентов-консервантов являются предшественники диоксида хлора. В особых случаях предшественники диоксида хлора включают стабилизированный диоксид хлора (СДХ), хлориты металлов, такие как хлориты щелочных и щелочноземельных металлов, подобные соединения и их смеси. Технический хлорит натрия является очень подходящим к применению предшественником диоксида хлора.

Комплексы, содержащие диоксиды хлора, такие как комплексы диоксида хлора с карбонатом, диоксида хлора с бикарбонатом и их смеси, также можно включить в состав смеси в качестве предшественников диоксида хлора. Точный состав химической композиции, состоящей из разных предшественников диоксида хлора, например СДХ и комплексов диоксида хлора, еще окончательно не понятен. Изготовление или получение определенных предшественников диоксида хлора описано МакНиколасом (McNicholas) в патенте US 3,278,447, включенном в полном объеме в данный текст в виде ссылки. Специфические примеры соединений СДХ, пригодные для использования, включают вещества, продающиеся под торговой маркой Purite7 компанией Allergan, Inc., продающиеся под торговой маркой Dura Klor компанией Rio Linda Chemical Company, Inc., и продающиеся под торговой маркой Anthium Dioxide компанией International Dioxide, Inc.

Предшественники диоксида хлора входят в состав данных композиций для обеспечения возможности надежного сохранения композиции. Концентрации, обеспечивающие надежное сохранение, находятся предпочтительно в диапазоне от приблизительно 0.0002 или приблизительно 0.002 до приблизительно 0.02% (масса/объем) и выше.

В случае когда предшественники диоксида хлора используются в качестве компонентов-консервантов, композиции предпочтительно имеют осмолярность, равную как минимум приблизительно 200 мОсмоль/кг, и содержат буферы, поддерживающие рН на приемлемом физиологическом уровне, например на уровне от приблизительно 6 до приблизительно 8 или приблизительно 10.

Данные композиции предпочтительно содержат эффективное количество компонента-электролита, то есть одного или нескольких электролитов, например, подобных тем, что присутствуют в настоящих или искусственных слезах. Примеры таких электролитов, особенно подходящих для использования в данных композициях, включают соли щелочноземельных металлов, такие как неорганические соли щелочноземельных металлов и их смеси, например соли кальция, соли магния и их смеси, но не ограничиваются ими.

Очень хорошие результаты получают при использовании электролитического компонента, выбранного из группы, состоящей из хлорида кальция, хлорида магния и их смесей.

Объем или концентрация такого компонента-электролита в данной композиции может широко варьироваться и зависит от множества факторов, например от применяемого специфического компонента-электролита, специфической композиции, в состав которой должен войти электролит, и подобных факторов. В одном воплощении количество используемого компонента-электролита подбирается таким образом, чтобы оно как минимум частично соответствовало или практически полностью воспроизводило концентрацию электролитов в настоящих слезах человека. Предпочтительно, концентрация компонента-электролита находится в диапазоне от приблизительно 0.01 до приблизительно 0.5 или приблизительно 1% в данной композиции.

Данные композиции можно получить, используя традиционные процедуры и техники. Например, данные композиции можно получить, смешивая компоненты, например, одновременно в одной партии.

Для иллюстрации, в одном воплощении порции полианионного компонента смешивают с очищенной водой и дают им раствориться в очищенной воде, например, смешивая и/или встряхивая. Другие компоненты, такие как буферный компонент, тонический компонент, электролитический компонент, компонент-консервант и подобные компоненты, последовательно вводят в состав смеси. Полученный раствор стерилизуют, например, паровой стерилизацией при температурах не менее около 100°С, например в диапазоне от приблизительно 120°С до приблизительно 130°С, в течение как минимум приблизительно 15 минут или минимум приблизительно 30 минут, например в течение периода длиной от приблизительно 45 до приблизительно 60 минут. В одном воплощении компонент-консервант предпочтительно добавляется к смеси после стерилизации. Конечный продукт предпочтительно фильтруют, например, через 20-микронный стерильный картриджный фильтр, например 20-микронный картриджный фильтр, например, такой, который выпускается Pall под торговым названием HDC II, для получения чистого, гомогенного раствора, который затем асептически упаковывают в контейнеры, например в контейнеры из полиэтилена низкой плотности.

Иначе, каждую порцию полианионного компонента можно смешать с очищенной водой для получения отдельных порций растворов полианионного компонента. Смешивая отдельные порции растворов полианионных компонентов, можно легко получить раствор, содержащий необходимое и строго определенное количество частей отдельных полианионных компонентов. Смешанный раствор потом можно дополнить другими компонентами, стерилизовать, фильтровать и упаковать в контейнеры, как было описано выше.

В одном воплощении делают раствор порций полианионного компонента в очищенной воде так, как описано выше. Раствор стерилизуют, например, так, как описано выше. Другие компоненты, которые планируют включить в состав конечной композиции, по отдельности растворяют в очищенной воде. Этот раствор фильтруют через стерильный фильтр, например через 0.2-микронный стерильный фильтр, например, такой, который продается Pall под торговым названием Suporflow, в содержащий полианионный компонент раствор для получения конечного раствора. Конечный раствор фильтруют, например, так, как описано выше, для получения чистого, гомогенного раствора, который затем асептически упаковывают в контейнеры, как описано выше.

Данные композиции можно эффективно применять в соответствии с необходимостью способами, которые включают введение эффективного количества композиции для глаз в случае возникновения потребности в увлажнении, например в случае, если глаз подвержен сухому кератиту или имеется предрасположенность к возникновению сухого кератита. При необходимости введение препарата можно повторить несколько раз для обеспечения эффективного увлажнения глаза. Способ введения данной композиции зависит от формы композиции. Например, если композиция представляет собой раствор, ее можно закапать в глаз в виде капель, например, из обычной глазной пипетки. В общем случае данные композиции можно применять абсолютно такими же способами, как и обычно используемые офтальмические композиции. Такое введение описанных композиций обеспечивает значительные и неожиданные преимущества, что описывается данным документом.

Последующие примеры иллюстрируют определенные аспекты данного изобретения, не подразумевая при этом ограничений.

Пример 1

В данном эксперименте клетки эпителия роговицы глаза кролика изолировали и культивировали в условиях, приводящих к дифференцировке в многослойную «эрлифт» культуру, включающую базальные, многоугольные и сквамозные клетки. В результате роста и дифференцировки клеток между клетками появляются плотные контакты, которые являются необходимой основой для возникновения трансэпителиальной электрической устойчивости (ТЭЭУ) клеточных пластов между апикальной и базальной поверхностью. Величина ТЭЭУ является чувствительной мерой клеточного роста, дифференцировки и здоровья.

После 5 дней культивирования, в течение которых формируется слоистая структура, различные чашки с культурами помещались в гипертоническую жидкость (400 мОсмоль/кг) с или без добавления одного из 6 потенциальных совместимых растворимых веществ в низких концентрациях (2 мМ). После 22 часов обработки измеряли ТЭЭУ. Уровень ТЭЭУ выражали в процентах от величины ТЭЭУ такой же культуры в изотонических условиях (300 мОсмоль/кг). Результаты теста представлены в таблице 1.

Таблица 1Результаты тестаСовместимое растворимое веществоТЭЭУ (% от изотонического контроля) через 22 часаИзотонический контроль100%Гипертонический контроль23.32 мМ Таурин39.82 мМ Бетаин53.32 мМ Карнитин118.92 мМ Эритрит107.42 мМ Мио-Инозит74.82 мМ Ксилит94.1

Эти результаты показывают, что все протестированные вещества-кандидаты имеют некоторые осмопротекторные свойства и увеличивают ТЭЭУ по сравнению с гипертоническим контролем. Неожиданно из всех протестированных агентов карнитин оказался самым эффективным. Не желая ограничивать изобретение определенной теорией или операцией, мы предполагаем, что хорошие результаты, полученные при использовании карнитина, могут быть обусловлены выполнением карнитином множества ролей в энергетическом метаболизме и других клеточных процессах, а также его осмопротекторными свойствами.

Далее также неожиданно эритрит показал лучшие результаты среди протестированных полиолов. Ксилит и мио-инозит показали хорошие результаты.

Эти результаты показывают, что каждое из 6 соединений-кандидатов, предпочтительно карнитин, эритрит, ксилит и мио-инозит, можно использовать в офатальмических композициях, например, для преодоления гипертонических условий на поверхности глаза человека или животного.

Кроме того, не желая ограничивать изобретение какой-либо определенной теорией или операцией, мы предполагаем, что благодаря тому что эти соединения выполняют различные роли, сочетание двух или более соединений может оказаться удачным, например, сочетание как минимум одного полиола и минимум одной аминокислоты, возможно, обеспечит более надежную защиту клеток поверхности роговицы от инсульта, развившегося, например, в результате иссушения и гиперосмолярности, как при сухом кератите.

Пример 2

Фосфорилированная JNK (активированная форма ассоциированной со стрессом протеин киназы, SAPK) играет ключевую роль в индукции воспаления и апоптоза в ответ на стресс, в том числе при гиперосмолярности.

От доноров в возрасте 16-59 лет из Техасского Lions Eye Bank (Хьюстон, Техас) были получены ткани склеры и роговицы человека. Из лимбальных эксплантов выращивали клетки эпителия роговицы. Вкратце, после осторожного удаления клеток роговицы, большей части конъюнктивы, ириса и эндотелия роговицы лимбальное кольцо разрезалось на 12 равных частей (размером приблизительно 2 на 2 мм каждый). По два таких кусочка помещали в каждую чашку 6-чашечных культуральных планшетов эпителиальной стороной вверх и каждый эксплант покрывали каплей фетальной коровьей сыворотки (FBS) на ночь. Затем экспланты культивировали в среде SHEM, которая представляла собой смесь 1:1 Dulbecco модифицированной Eagle среды (DMEM) и Ham F-12 среды, содержащей 5 нг/мл ЭФР (EGF), 5 µг/мл инсулина, 5 µг/мл трансферрина, 5 нг/мл селенита натрия, 0.5 µг/мл гидрокортизона, 30 нг/мг холерного токсина А, 0.5% DMSO, 50 µг/мл гентамицина, 1.25 µг/мл амфотерицина В и 5% FBS, при 37°С в 5% СО₂ и влажности 95%. Среду меняли каждые 2-3 дня. Эпителиальный фенотип данных культур был подтвержден характерной морфологией и иммунофлуоресцентным окрашиванием антителами на цитокератин (АЕ-1/АЕ-3).

Культуральные чашки, планшеты, центрифужные пробирки и другие пластиковые предметы были получены от Becton Dickinson (Линкольн Парк, Нью Джерси).

Использовались Dulbecco модифицированная Eagle среда (DMEM), Ham F-12 среда, Фунгизон и гентамицин производства Invitrogen-GIBCO BRL (Гранд Айланд, Нью Джерси). Использовалась фетальная коровья сыворотка (РВЗ) производства Hyclone (Логан, Юта).

Серия первичных субконфлюэнтных культур эпителиальных клеток роговицы (выращиваемых в течение 12-14 дней, приблизительно 4-5×10⁵ клеток на чашку) трижды промывали сохраняющим буферным солевым раствором (РВ8)и переводили в сбалансированный солевой раствор Earle (Earle's Balanced Salt Solution, EBSS, 300 мОсмоль/кг) на 24 часа перед обработкой. Клетки эпителия роговицы культивировали в течение 1 часа в равном объеме (2.0 мл на чашку) среды EBSS или среды осмолярностью 400 м0 смоль/кг, полученной путем добавления 53 мМ Nad или сахарозы, с примесью либо внутренней соли L-карнитина, либо гидрохлорида бетаина, либо эритрита, либо ксилита (все в концентрации 2 мМ), добавленных за 60 минут до внесения NaCl или сахарозы. Также были приготовлены и протестированы образцы, не содержащие этих осмопротекторов.

Прикрепленные клетки лизировали в буфере Beadlyte® Buffer В (входящем в состав Beadlyte® Cell Signaling buffer kit. Upstate Biotechnology, Лейк Пласид, Нью-Йорк) с добавлением не содержащей EDTA таблетки - смеси ингибиторов протеаз (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана), в течение 15 минут. Клеточные экстракты центрифугировали при ускорении 12,000×g в течение 15 минут при комнатной температуре, супернатанты хранили при -80°С все время перед анализом способом Вестерн блота. Тотальную концентрацию белка в клеточных экстрактах определяли с помощью Micro BCA protein assay kit (Pierce, Рокфолд, Иллинойс).

Уровень JNK1 и JNK2 определялся для каждой композиции способом Вестерн блота со специфическими антителами на фосфорилированные формы каждой киназы.

Анализ способом Вестерн блота проводили следующим образом. Образцы белка (50 µg на полосу) смешивали с 6×SDS буфером и кипятили в течение 5 минут перед загрузкой. Белки разделяли способом электрофореза в SDS полиакриламидном геле (4-15% Tris-HCl, градиентный гель производства Bio-Rad, Hercules, Калифорния) и электронным образом переносили на поливинилидиндифторидные мембраны (РУВР) производства Millipore, Бедфорд, Массачусетс). Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в TTBS (50 мМ Tris, pH 7.5, 0.9% NaCl и 0.1% Tween-20) в течение одного часа при комнатной температуре (RT), a затем инкубировали в течение 2 часов при RT в растворе 1:1000 кроличьих антител на фосфо-р38 МАРК (Cell Signaling, Беверли, Массачусетс), 1:100 кроличьих антител на фосфо-JNK или 1:500 растворе моноклональных антител на фосфо-р44/42 ERK (Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния).

После трех промываний в TTBS мембраны инкубировали в течение одного часа при RT в растворе вторых антител (козьи антитела IgG на кролика), конъюгированных с пероксидазой хрена (1:2000 раствор, Cell Signaling, Беверли, Массачусетс), или козьих антител IgG на мышь (1:5000 раствор, Pierce, Рокфолд, Иллинойс). После четырехкратной промывки мембраны сигнал детектировался с помощью ECL хемифлуоресцентного реагента (Amersham, Пискатавэй, Нью-Джерси), а изображения были получены с помощью Kodak image station 2000R (Eastman Kodak, Нью Хевен, Коннектикут). Проводили стриппинг мембран в 62,5 мМ Tris HCl, pH 6.8, содержащем 2% SDS и 100 мМ α-меркаптноэтанола, при 60°С в течение 30 минут, затем на них снова проводились пробы с помощью 1:100 раствора кроличьих антител на JNK (Santa Cruz Biotechnology) HnH 1:1000 раствора кроличьих антител на ERK или р38 МАРК (Cell Signaling). Эти три разновидности антител способны определять как фосфорилированную, так и нефосфорилированную формы, что дает представление об общем уровне данных МАР-киназ. Сигналы детектировали и фиксировали так же, как было описано выше.

Оценка интенсивности производилась путем анализа картины итоговых бэндов.

Результаты теста представлены на Фиг.1 и 2.

Что касается Фиг.1, ни эритрит, ни ксилит не оказывали влияния на активацию JNK. Однако в отношении Фиг.2 можно сказать, что заметно существенное снижение уровней JNK1 и JNK2 в культурах с L-карнитином и бетаином по сравнению со средой 400 мОсмоль/кг без добавок. В культурах на среде 300 мОсмоль/кг эффект был не таким выраженным.

Пример 3

В другой серии экспериментов использовали анализ Beadlyte® Cell Signaling Assay. Этот анализ представляет собой иммунологический анализ с использованием флуоресцентных, связанных с бусинами, образующих «бутерброд» антител. Например, каждый образец (10 µπ/25 µπ) пипетировали в лунку 96-луночного планшета и инкубировали в 25 µπ разведенных 5-кратно бусин (beads), связанных с антителами, специфически захватывающими белки, в течение ночи. Такие антитела могут специфически захватывать белки, такие как JNK, р38 или ERK. Инкубация в течение ночи применялась для осуществления реакции взаимодействия захватывающих бусин (beads) с белками клеточных лизатов.

Бусины отмывали и смешивали со специфическими биотинилированными репортерными антителами на фосфо-МАРК или тотальную МАРК, а затем стрептавидином-фикоэритрином. Уровень тотальной или фосфорилироавнной МАРК определяли с помощью системы Luminex 100™ system (Luminex, Остин, Техас). Читалось 50 событий на бусину, и данные, полученные с помощью программного обеспечения Bio-Plex Manager, были перенесены в Microsoft Excel® для дальнейшего анализа. Результаты были представлены как процентное отношение фосфорилированной МАРК к тотальной МАРК.

Результаты этих тестов представлены на Фиг.3, 4 и 5.

На Фиг.3 показано отношение фосфорилированной JNK к тотальной JNK. На Фиг.4 показано отношение фосфорилированной р38 к тотальной р38. На Фиг.5 показано отношение фосфорилированной ERK к тотальной ERK.

Как показано на Фиг.3, все соединения-кандидаты, то есть и эритрит, и ксилит, и L-карнитин, и бетаин, уменьшали отношение фосфо-JNK к тотальной по сравнению с гипертоническим контролем.

Что касается Фиг.4, все соединения-кандидаты, за исключением бетаина, уменьшали отношение фосфо-р38 к тотальной по сравнению с гипертоническим контролем.

Как показано на Фиг.5, соединения-кандидаты полиолы, то есть эритрит и ксилит, снижали количество ERK относительно гипертонического контроля. Аминокислоты, бетаин и карнитин, такого эффекта не вызывали.

Пример 4

Был повторен Пример 1 за тем исключением, что были использованы различные концентрации каждого использованного соединения-кандидата, а ТЭЭУ измерялось несколько раз в интервале от 0 до 24 часов.

Результаты этих тестов представлены на Фиг.6. Так же, как и в примере 1, показатель ТЭЭУ выражается как процентное отношение ТЭЭУ к изотоническому контролю.

Данные результаты показывают, что дозозависимый отклик наблюдался при использовании L-карнитина, бетаина и эритрита.

Композицию, содержащую бетаин и стабилизированный диоксид хлора в качестве консерванта, исследовали на совместимость компонентов. Было обнаружено, что бетаин не является оптимально совместимым с данной композицией. Таким образом, бетаин не пригоден для использования в сочетании с определенными консервантами, например со стабилизированным диоксидом хлора. Однако бетаин можно успешно применять в качестве совместимого растворимого вещества в офтальмических композициях, использующих другие способы консервации или не содержащих консервантов, например, в случае одиночного или однодозового применения.

Пример 5

Был воспроизведен Пример 4 за тем исключением, что использовались композиции, содержащие комбинации совместимых растворимых веществ. Также были протестированы композиции, содержащие в качестве совместимого растворимого вещества исключительно глицерин.

Результаты теста представлены на Фиг.7 и 8.

Данные этих тестов показывают, что сочетание различных совместимых растворимых веществ потенциально может обеспечить дополнительные преимущества.

Пример 6

Было показано, что продомен Главного Основного Белка (МВР) является полипептидом, состоящим из 90 аминокислотных остатков.

В результате применения хорошо известных и поставленных методик был получен полипептидный аналог данной полипептидной цепи из 90 аминокислотных остатков.

Офтальмическая композиция была получена в результате смешивания следующих компонентов:

Вышеупомянутый полипетидныйКонцентрация % (масса/объем)аналог0.5%Глицерин1.0%Эритрит0.5%Борная кислота0.65Борат Натрия0.25Цитрат Натрия0.1Хлорид Калия0.01Purite®⁽¹⁾0.01Гидроксид Натрия 1Nдо уровня рН 7.2Соляная кислота 1Nдо уровня рН 7.2Очищенная воданеобходимое количество

(1) Purite® является зарегистрированной торговой маркой Allergan, Inc., стабилизированного диоксида хлора. Это соединение добавляется в смесь после термической стерилизации.

Пример 7

Композиция, описанная в примере 6, в форме глазных капель закапывалась в глаз человеку, которому предстояло перенести процедуру, в ходе которой глаз подвергается воздействию лазерной энергии, в частности хирургическую процедуру LASIK.

После хирургической процедуры пациент в меньшей степени страдал от боли, и/или дискомфорта, и/или раздражения глаз, и/или происходило ускоренное восстановление после хирургического вмешательства по сравнению с периодом после аналогичной хирургической процедуры с использованием той же композиции, не содержащей полипептидного аналога.

Пример 8

Композиция, описанная в примере 6, в форме глазных капель закапывалась в глаз человеку, проходящему процедуру, в ходе которой глаз подвергается воздействию лазерной энергии, в частности хирургическую процедуру LASIK.

Пример 9

Композиция, описанная в примере 6, в форме глазных капель закапывалась в глаз человеку, непосредственно после процедуры, в ходе которой глаз подвергался воздействию лазерной энергии, в частности хирургическую процедуру LASIK.

Пример 10

Путем смешивания различных компонентов (представленных в нижеследующей таблице) была получена серия из четырех офтальмических препаратов, соответствующих данному изобретению.

ИнгредиентКонцентрация % (масса/объем) АВСDКарбоксиметилцеллюлоза (КМЦ)1.0--0.5Глицерин0.50.5-0.5Эритрит0.250.250.750.75Борная кислота0.600.600.600.60Декагидрат Бората Натрия0.0450.0450.0450.045Дигидрат Хлорида Кальция0.0060.0060.0060.006Гексагидрат Хлорида Магния0.0060.0060.0060.006Purite ®⁽¹⁾0.00750.00750.0750.075Гидроксид Натрия 1Nдо рН 7.2до рН 7.2до рН 7.2до рН 7.2Соляная кислота 1Nдо рН 7.2до рН 7.2до рН 7.2до рН 7.2Очищенная воданеобходимое количествонеобходимое количествонеобходимое количествонеобходимое количество(1) Purite® является зарегистрированной торговой маркой Allergan, Inc., стабилизированного диоксида хлора. Это соединение добавляется в смесь после термической стерилизации.

Пример 11