Способ дифференциации нейрональных клеток из эмбриональных стволовых (эс) клеток - RU2006142742A

Реферат

1. Способ индуцированной дифференциации эмбриональных стволовых (ЭС) клеток в нейрональные клетки-предшественники или прогениторные клетки, включающий

культивирование ЭС клеток,

формирование зародышевых тел (ЗТ),

обработку ЗТ ретиноевой кислотой (РК) и

диссоциацию ЗТ для получения культуры нейрональных клеток-предшественников,

в котором формирование ЗТ включает отбор ЭС клеток с высокой пролиферативной активностью и высев этих клеток с определенной плотностью для формирования ЗТ.

2. Способ по п.1, в котором клетки высевают с плотностью примерно 0,5×10⁵-5×10⁵ клеток в мл.

3. Способ по п.2, в котором формирование ЗТ включает высев ЭС клеток с плотностью примерно 2,5×10⁵-3,5×10⁵ клеток в мл.

4. Способ по пп.1, 2 или 3, в котором ЗТ поддерживаются в неадгерентной культуре до диссоциации клеток ЗТ.

5. Способ по пп.1-3, включающий изучение морфологии ЭС клеток и отбор морфологически гомогенных ЭС клеток для формирования ЗТ.

6. Способ по п.5, включающий отбор ЭС клеток, обладающих одним или несколькими из следующих морфологических свойств: ростом в виде плоского монослоя, отсутствием непосредственного контакта между соседним клетками, крупными ядрами, большим количеством ядрышек, отсутствием роста клеток поверх друг друга или в виде форм, напоминающих колонии.

7. Способ по п.6, включающий определение стадии пролиферации ЭС клеток и отбор клеток с высокой пролиферативной активностью для формирования ЗТ.

8. Способ по п.7, в котором культивирование ЭС клеток включает пассирование ЭС клеток в отсутствии питающих клеток.

9. Способ по пп.1-3, в котором культивирование ЭС клеток включает пассирование путем высева ЭС клеток с плотностью примерно 0,5-2×10⁵ клеток на см и диссоциацию ЭС клеток через 2 сут после высева.

10. Способ по п.9, в котором пассирование повторяют, по меньшей мере, дважды в отсутствии питающих клеток.

11. Способ по пп.1-3, включающий диссоциацию ЭС клеток для получения суспензии отдельных клеток, в которой примерно менее 5% клеток образуют агрегаты из 4 или более клеток, и высев клеток для формирования ЗТ.

12. Способ по пп.1-3, в котором диссоциация ЗТ заключается в диссоциации клеток ЗТ трипсином для формирования суспензии клеток диссоциированных ЗТ с последующим фильтрованием суспензии для удаления скоплений клеток.

13. Способ по п.12, в котором клетки диссоциированных ЗТ фильтруют через ячейки размером примерно 40 мкм.

14. Способ по пп.1-3, включающий хранение клеток диссоцированных ЗТ путем замораживания клеток.

15. Способ по пп.1-3, дополнительно включающий высев и культивирование клеток диссоциированных ЗТ для получения нейронов и необязательно культивирование нейронов.

16. Способ по п.15, в котором клетки диссоциированных ЗТ высевают с плотностью примерно 0,5×10⁵-2,5×10⁵ клеток на см².

17. Способ по п.16, в котором клетки диссоциированных ЗТ высевают с плотностью примерно 1×10⁵-1,5×10⁵ клеток на см².

18. Способ по п.15, включающий замену культуральной среды клеток диссоциированных ЗТ примерно через 1-6 ч после высева клеток диссоциированных ЗТ.

19. Способ по п.18, включающий замену культуральной среды примерно через 1-3 ч после высева.

20. Способ по п.19, в котором клетки диссоциированных ЗТ или нейроны не культивируют в присутствии сыворотки.

21. Способ по п.15, в котором нейрональные клетки-предшественники, прогениторные клетки или нейрональные клетки не культивируют в присутствии ростовых факторов.

22. Способ по п.21, в котором нейрональные клетки-предшественники, прогениторные клетки или нейрональные клетки не культивируют на среде Neurobasal.

23. Способ по пп.1-3, в котором отсутствует стадия выбраковки клеток.

24. Способ по пп.1-3, в котором ЭС клетки не являются ЭС клетками человека.

25. Способ по пп.1-3, включающий идентификацию, по меньшей мере, 80% клеток диссоциированных ЗТ в качестве нейрональных клеток-предшественников или прогениторных клеток.

26. Способ по пп.1-3, включающий идентификацию, по меньшей мере, 99% клеток диссоциированных ЗТ в качестве нейрональных клеток-предшественников или прогениторных клеток.

27. Способ по п.15, включающий идентификацию, по меньшей мере, 80% клеток в качестве нейронов.

28. Способ по п.27, включающий идентификацию, по меньшей мере, 90% клеток в качестве нейронов.

29. Способ изучения, включающий определение одной или нескольких характеристик нейрональных клеток-предшественников, или прогениторных клеток, или нейрональных клеток.

30. Способ изучения по п.29, в котором характеристика или характеристики являются одной или несколькими из следующих: рост нейритов или элонгация/дегенерация нейритов, нейрональная форма, гибель нейрональных клеток, нейрогенез, нейрональная дифференциация, электрическая активность, синаптогенез и/или маркеры нейрональных клеток.

31. Способ изучения по п.29 или 30, в котором клетки получают способом по одному из пп.1-28.

32. Способ изучения по п.31, включающий

индуцируемую дифференциацию ЭС клеток в нейрональные клетки-предшественники, или прогениторные клетки, или нейрональные клетки по одному из пп.1-28 и

определение одной или нескольких характеристик нейрональных клеток-предшественников, или прогениторных клеток, или нейрональных клеток при исследуемом условии.

33. Способ изучения по п.32, включающий

культивирование нейрональных клеток-предшественников, или прогениторных клеток, или нейрональных клеток при первом условии,

культивирование нейрональных клеток-предшественников, или прогениторных клеток, или нейрональных клеток при втором условии,

определение или подсчет одной или нескольких нейрональных характеристик клеток и

сравнение одной или нескольких нейрональных характеристик клеток, выращенных при первом условии, с такой же характеристикой или таким же характеристиками клеток, выращенных при втором условии соответственно.

34. Способ изучения по п.33, в котором нейрональной характеристикой является элонгация нейритов и который включает:

измерение уровней экспрессии нейрит-специфического белка и

сравнение уровней экспрессии нейрит-специфического белка,

в котором повышенный уровень экспрессии при первом условии показывает, что первое условие увеличивает элонгацию нейритов.

35. Способ изучения по п.33, в котором нейрональной характеристикой является дегенерация нейритов и который включает:

измерение уровней экспрессии нейрит-специфического белка и

сравнение уровней экспрессии нейрит-специфического белка,

в котором пониженный уровень экспрессии при первом условии показывает, что первое условие культивирования увеличивает дегенерацию нейритов.

36. Способ идентификации агента, который ингибирует или понижает рост дегенерации нейритов, вызванный соединением, о котором известно, что оно увеличивает дегенерацию нейритов, включающий:

культивирование нейрональных клеток-предшественников, или прогениторных клеток, или нейрональных клеток в присутствии исследуемого агента, а также при условии, о котором известно, что оно увеличивает дегенерацию нейритов,

культивирование нейрональных клеток-предшественников, или прогениторных клеток, или нейрональных клеток в отсутствии исследуемого агента, а также при условии, о котором известно, что оно увеличивает дегенерацию нейритов,

измерение или определение уровней дегенерации нейритов в присутствии и в отсутствии исследуемого агента и

сравнение уровней дегенерации нейритов в присутствии исследуемого агента с уровнями дегенерации нейритов в отсутствии исследуемого агента,

в котором пониженный уровень дегенерации нейритов в присутствии исследуемого агента по сравнению с уровнем дегенерации нейритов в отсутствии исследуемого агента показывает, что этот агент ингибирует или снижает увеличение уровня дегенерации нейритов, вызванного или связанного с данным условием.

37. Способ по п.36, в котором уровни дегенерации нейритов измеряются путем подсчета уровней экспрессии нейрит-специфического белка, причем повышенный уровень экспрессии нейрит-специфического белка в присутствии исследуемого агента по сравнению с уровнем экспрессии нейрит-специфического белка в отсутствии этого агента показывает, что исследуемый агент ингибирует или понижает увеличение уровня дегенерации нейритов, вызванного или связанного с данным условием.

38. Способ изучения по п.33, в котором нейрональная характеристика является гибелью нейрональных клеток, включающий

культивирование нейронов при первом условии,

культивирование нейронов при втором условии,

измерение или определение гибели нейрональных клеток, выращенных при первом и втором условии и

сравнение уровней гибели нейрональных клеток при первом условии с уровнями гибели нейрональных клеток при втором условии,

в котором повышенный уровень гибели нейрональных клеток при первом условии при сравнении с уровнем гибели нейрональных клеток при втором условии показывает, что это соединение увеличивает гибель клеток, и/или

в котором пониженный уровень гибели нейрональных клеток при первом условии по сравнению с уровнем гибели нейрональных клеток при втором условии показывает, что это соединение понижает гибель нейрональных клеток.

39. Способ изучения по п.38, в котором нейроны экспрессируют нейротрофин р75 и/или апоптический белок.

40. Способ идентификации агента, который ингибирует или понижает рост гибели нейрональных клеток, возникающий при условии, о котором известно, что оно увеличивает гибель нейрональных клеток, включающий

культивирование нейронов в присутствии исследуемого агента и при условии, о котором известно, что оно повышает гибель нейрональных клеток,

культивирование нейронов без исследуемого агента и при условии, о котором известно, что оно повышает гибель нейрональных клеток,

измерение или определение уровней гибели нейрональных клеток в присутствии исследуемого агента или без него и

сопоставление уровней гибели нейрональных клеток в присутствии исследуемого агента с уровнями гибели нейрональных клеток при отсутствии исследуемого агента,

в котором пониженный уровень гибели нейрональных клеток в присутствии исследуемого агента по сравнению с уровнем гибели нейрональных клеток в отсутствии исследуемого агента показывает, что этот агент ингибирует или понижает рост гибели нейрональных клеток, вызванный этим условием.

41. Способ изучения по п.33, в котором культивирование при первом условии включает культивирование в присутствии исследуемого соединения или обработку клеток исследуемым соединением, и в котором культивирование при втором условии включает культивирование в отсутствии исследуемого соединения или отсутствие обработки клеток исследуемым соединением.

42. Способ изучения по одному из пп.29 или 30 для идентификации маркера, указывающего на стадию дифференциации клетки, включающий

индукцию дифференциации ЭС клеток для получения нейрональных клеток-предшественников или прогениторных клеток и/или

культивирование нейрональных клеток-предшественников или прогениторных клеток,

сравнение уровней экспрессии белков в клетках на одной стадии дифференциации с уровнями экспрессии белков в клетках на второй стадии дифференциации, и

идентификацию белков, у которых уровни экспрессии различны в клетках на первой и второй стадиях дифференциации,

в котором различие уровней экспрессии показывает, что этот белок может применяться в качестве маркера для выявления стадии дифференциации клетки.

43. Способ изучения по п.29 или 30, в котором нейрональной характеристикой является синаптогенез и который включает измерение электрофизиологической активности клеток и/или выявление, или измерение экспрессии одного или нескольких маркеров синаптогенеза.

44. Способ, включающий

получение первой и второй культур нейрональных клеток, или нейрональных клеток-предшественников, или прогениторных клеток, причем клетки в первой культуре имеют генотип, отличающийся от генотипа клеток во второй культуре, и

сравнение нейрональных клеток-предшественников, или прогениторных клеток, или нейронов в первой культуре с нейрональными клетками-предшественниками, или прогениторными клетками, или нейронами во второй культуре.

45. Способ по п.44, в котором клетки в первой культуре содержат мутацию в интересующем гене, а клетки во второй культуре не содержат этой мутации.

46. Способ по п.44, в котором клетки в первой культуре содержат интродуцированный ген, а клетки во второй культуре не содержат этого интродуцированного гена.

47. Способ по п.44, в котором клетки в первой культуре проявляют сверхэкспрессию эндогенного гена, а клетки во второй культуре не проявляют сверхэкспрессии этого эндогенного гена.

48. Способ по одному из пп.44-47, включающий индуцированную дифференциацию ЭС клеток в нейрональные клетки-предшественники, или прогениторные клетки, или нейрональные клетки согласно способу по одному из пп.1-28.

49. Способ по п.48, в котором в первой культуре ЭС клетки содержат мутацию в интересующем гене, а во второй культуре эти клетки не содержат этой мутации.

50. Способ по п.48, включающий трансфекцию первой культуры диссоциированного ЗТ конструкцией нуклеиновой кислоты и в результате этого изменяющий генотип клеток в первой культуре по сравнению с генотипом клеток во второй культуре.

51. Способ по пп.44-47, дополнительно включающий

культивирование первой и второй культур нейрональных клеток-предшественников, или прогениторных клеток, или нейрональных клеток при исследуемом условии,

выявление, измерение, наблюдение или определение одной или нескольких нейрональных характеристик клеток и

сравнение нейрональных характеристик клеток в первой культуре с нейрональными характеристиками клеток во второй культуре.

52. Способ по п.51, в котором культивирование при первом условии включает культивирование клеток в присутствии Аβ-пептида, а культивирование клеток при втором условии включает культивирование клеток в отсутствии Аβ-пептида.

53. Способ по п.52, в котором нейрональной характеристикой является деградация нейритов.