Обогащенная питательная среда для выращивания клеток, извлеченных из ткани пуповины человека - RU2015128276A

1. Культуральная среда для выращивания опорнозависимых клеток, содержащая

аминокислоты L-аргинин, L-цистин, L-цистеин, L-глутамин, глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин, L-валин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-таурин;

витамины кальция D-пантотенат, холина хлорид, фолиевую кислоту, I-инозитол, ниацинамид, пиридоксаль, рибофлавин, тиамин, d-биотин, пиридоксин и витамин B₁₂ (цианокобаламин);

соли кальция хлорид, калия хлорид, магния сульфат, натрия хлорид и одну или более солей натрия фосфата;

нуклеозиды тимидин, аденозин, цитидин, уридин и гуанозин;

инсулин, трансферрин, липоевую кислоту/тиоктовую кислоту, этаноламин, натрия селенит и один или более источников энергии.

2. Культуральная среда по п. 1, причем культуральная среда содержит

по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л L-аргинина, по меньшей мере приблизительно 0,02 г/л L-цистина, по меньшей мере приблизительно 0,2 г/л L-глутамина, по меньшей мере приблизительно 0,01 г/л глицина, по меньшей мере приблизительно 0,02 г/л L-гистидина, по меньшей мере приблизительно 0,09 г/л L-изолейцина, по меньшей мере приблизительно 0,09 г/л L-лейцина, по меньшей мере приблизительно 0,09 г/л L-лизина, по меньшей мере приблизительно 0,02 г/л L-метионина, по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л L-фенилаланина, по меньшей мере приблизительно 0,03 г/л L-серина, по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-треонина, по меньшей мере приблизительно 0,009 г/л L-триптофана, по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-тирозина, по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-валина, по меньшей мере приблизительно 0,005 г/л L-цистеина, по меньшей мере приблизительно 0,0004 г/л L-аланина, по меньшей мере приблизительно 0,01 г/л L-аспарагина, по меньшей мере приблизительно 0,006 г/л L-аспарагиновой кислоты, по меньшей

мере 0,03 г/л L-глутаминовой кислоты, по меньшей мере приблизительно 0,005 г/л L-пролина и по меньшей мере приблизительно 0,0003 г/л L-таурина;

от приблизительно 5×10^-6г/л до приблизительно 0,015 г/л каждого из витаминов;

по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л кальция хлорида безводного, по меньшей мере приблизительно 0,1 г/л калия хлорида; по меньшей мере приблизительно 0,2 г/л магния сульфата, по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л натрия фосфата одноосновного, H₂O и по меньшей мере приблизительно 0,0005 г/л натрия фосфата двухосновного гептагидрата (Na₂HPO_4·7H₂O);

по меньшей мере приблизительно 0,0001 г/л тимидина и по меньшей мере приблизительно по 0,005 г/л аденозина, цитидина, уридина и гуанозина; и

по меньшей мере приблизительно 0,003 г/л инсулина, по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л трансферрина, по меньшей мере приблизительно 5×10^-6г/л липоевой кислоты/тиоктовой кислоты, по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л этаноламина и по меньшей мере приблизительно 0,00004 г/л натрия селенита.

3. Бессывороточный питательный раствор для выращивания опорнозависимых клеток, содержащий

аминокислоты L-аргинин, L-цистин, L-цистеин, глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин, L-валин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-таурин;

витамины кальция D-пантотенат, холина хлорид, фолиевую кислоту, I-инозитол, ниацинамид, пиридоксаль, рибофлавин, тиамин, d-биотин, пиридоксин и витамин B₁₂ (цианокобаламин);

соли натрия фосфат одноосновный и натрия фосфат двухосновный гептагидрат;

нуклеозиды аденозин, цитидин, уридин и гуанозин; и

инсулин, трансферрин, липоевую кислоту/тиоктовую кислоту, этаноламин и натрия селенит.

4. Способ культивирования выделенных клеток, полученных из

ткани пуповины человека, включающий

а) растущие клетки, полученные из тканей пуповины, засеянные на микроносителях в культуральную среду, содержащую аминокислоты, витамины, соли, нуклеозиды, липоевую/тиоктовую кислоту, этаноламин, инсулин, трансферрин, натрия селенит, причем в культуральную среду добавлена сыворотка, на протяжении достаточного периода времени, позволяющего клеткам достичь желаемой первоначальной плотности популяции;

b) добавление бессывороточного питательного раствора после достижения клетками желаемой первоначальной плотности популяции, причем бессывороточный питательный раствор содержит аминокислоты, витамины, соли, инсулин, трансферрин, этаноламин, липоевую кислоту/тиоктовую кислоту, натрия селенит; и

с) выращивание клеток на протяжении достаточного периода времени, позволяющего клеткам достичь желаемой конечной плотности популяции;

причем клетки, полученные из ткани пуповины человека, выделяют из ткани пуповины человека, по существу, не содержащими крови, способными к самообновлению и размножению в культуре, обладающими потенциалом к дифференцировке, экспрессирующими CD13, CD90 и HLA-ABC и не экспрессирующими CD34, CD117 и HLA-DR.

5. Способ по п. 4, причем способ дополнительно включает посев клеток на микроносители.

6. Способ по п. 4, причем способ дополнительно включает выделение клеток после стадии с.

7. Способ по п. 4, причем способ не требует замены среды.

8. Способ по п. 4, причем способ осуществляется в системе культивирования в центрифужных пробирках.

9. Способ по п. 4, в котором характеристики клеток до и после культивирования, по существу, одинаковы.

10. Способ по п. 9, в котором характеристики клеток до и после культивирования одинаковы.

11. Способ по п. 4, в котором желаемая первоначальная плотность популяции достигается через 3–4 дня.

12. Способ по п. 4, в котором микроносители имеют поверхность, обработанную амином.

13. Способ по п. 4, в котором культуральная среда содержит

аминокислоты L-аргинин, L-цистин, L-цистеин, L-глутамин, глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин, L-валин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-таурин;

витамины кальция D-пантотенат, холина хлорид, фолиевую кислоту, I-инозитол, ниацинамид, пиридоксаль, рибофлавин, тиамин, d-биотин, пиридоксин и витамин B₁₂ (цианокобаламин);

соли кальция хлорид, калия хлорид, магния сульфат, натрия хлорид и одну или более солей натрия фосфата;

нуклеозиды тимидин, аденозин, цитидин, уридин и гуанозин; и

инсулин, трансферрин, липоевую кислоту/тиоктовую кислоту, этаноламин, натрия селенит и один или более источников энергии.

14. Способ по п. 13, в котором одним или более источниками энергии являются D-глюкоза и натрия пируват.

15. Способ по п. 13, в котором культуральная среда содержит

по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л L-аргинина, по меньшей мере приблизительно 0,02 г/л L-цистина, по меньшей мере приблизительно 0,2 г/л L-глутамина, по меньшей мере приблизительно 0,01 г/л глицина, по меньшей мере приблизительно 0,02 г/л L-гистидина, по меньшей мере приблизительно 0,09 г/л L-изолейцина, по меньшей мере приблизительно 0,09 г/л L-лейцина, по меньшей мере приблизительно 0,09 г/л L-лизина, по меньшей мере приблизительно 0,02 г/л L-метионина, по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л L-фенилаланина, по меньшей мере приблизительно 0,03 г/л L-серина, по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-треонина, по меньшей мере приблизительно 0,009 г/л L-триптофана, по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-тирозина, по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-валина, по меньшей мере приблизительно 0,005 г/л L-цистеина, по меньшей мере приблизительно 0,0004 г/л L-аланина, по меньшей мере приблизительно 0,01 г/л L-аспарагина, по меньшей мере приблизительно 0,006 г/л L-аспарагиновой кислоты, по меньшей мере 0,03 г/л L-глутаминовой кислоты, по меньшей мере приблизительно 0,005 г/л L-пролина и по меньшей мере приблизительно 0,0003 г/л L-таурина;

от приблизительно 5×10^-6г/л до приблизительно 0,015 г/л каждого из витаминов;

по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л кальция хлорида безводного, по меньшей мере приблизительно 0,1 г/л калия хлорида; по меньшей мере приблизительно 0,2 г/л магния сульфата, по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л натрия фосфата одноосновного, H₂O и по меньшей мере приблизительно 0,0005 г/л натрия фосфата двухосновного гептагидрата (Na₂HPO₄·7H₂O);

по меньшей мере приблизительно 0,0001 г/л тимидина и по меньшей мере приблизительно по 0,005 г/л аденозина, цитидина, уридина и гуанозина; и

по меньшей мере приблизительно 0,003 г/л инсулина, по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л трансферрина, по меньшей мере приблизительно 5×10^-6г/л липоевой кислоты/тиоктовой кислоты, по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л этаноламина и по меньшей мере приблизительно 0,00004 г/л натрия селенита.

16. Способ по п. 13, в котором в культуральную среду добавляют от 2 до 20% ФБС.

17. Способ по п. 13, в котором в культуральную среду добавляют приблизительно 7,5%, приблизительно 10% или приблизительно 15% ФБС.

18. Способ по п. 13, в котором культуральная среда дополнительно содержит путресцин, стабилизатор и/или пенообразующий агент.

19. Способ по п. 4, в котором бессывороточный питательный раствор содержит

аминокислоты L-аргинин, L-цистин, L-цистеин, глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин, L-валин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-таурин;

витамины кальция D-пантотенат, холина хлорид, фолиевую кислоту, I-инозитол, ниацинамид, пиридоксаль, рибофлавин, тиамин, d-биотин, пиридоксин и витамин B₁₂ (цианокобаламин);

соли натрия фосфат одноосновный и натрия фосфат двухосновный гептагидрат;

микроэлементы меди (II) сульфат пентагидрат (CuSO_4·5H₂), цинка сульфат, гептагидрат (ZnSO₄·7H₂O);

нуклеозиды аденозин, цитидин, уридин и гуанозин; и

инсулин, трансферрин, этаноламин, липоевую кислоту/тиоктовую кислоту и натрия селенит.

20. Способ по п. 19, в котором бессывороточный питательный раствор дополнительно содержит путресцин, стабилизатор и/или пенообразующий агент.