Способ получения активатора плазминогена ткани - RU2005786C1

Код документа: RU2005786C1

Чертежи

Описание

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения лекарственного препарата - активатора плазминогена ткани (АПТ).

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

П р и м е р 1. Эффект алифатических монокарбоновых кислот.

Культуры клеток инкубируют при температуре 37оС в термостате и подвергают аэрации смесью двуокиси углерода и воздуха, содержащей 7,5% двуокиси углерода, при относительной влажности воздуха 100% . В зависимости от объема используемой культуры применяют различные емкости. Для получения основной культуры клетки используют при плотности 0,2-0,3х106 на 1 мл и субклонируют их каждые 2-3 дня.

Органические вещества (см. табл. 1) добавляют в разведении 1: 100, т. е. их сначала растворяют в среде или, если они являются труднорастворимыми, то сначала их растворяют в этиленовом спирте и затем добавляют к среде, после чего содержащую органическое вещество среду добавляют к содержащей клетке среде в объемном соотношении 1: 100.

С целью стимуляции синтеза АПТ клетки берут из экспоненциально растущей культуры и в пластмассовых трубках подвергают центрифугированию в течение 10 мин при 1000 g в центрифуге Бекманна. После декантирования надосадочной жидкости оставшиеся клетки повторно суспендируют в свежей среде.

Для получения АПТ в содержащей сыворотку среде используют в качестве свежей среды среду F12/DMEM, содержащую 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицин. Полученную суспензию культивируют в пластинах площадью 2 см2 при плотности 0,2-0,3х106 клеток/мл.

Для получения АПТ в свободной от сыворотки среде клетки предварительно держат в среде, содержащей - 1-2% эмбриональной телячьей сыворотки, в течение 3-4 дней, отделяют центрифугированием и оставшиеся клетки повторно суспендируют в свободной сыворотки среде и переводят в пластинки площадью 2 см2 при плотности 0,4-0,5х106 клеток/мл. В процессе культивирования берут или получают аликвоты надосадочных жидкостей клеток и экстрактов клеток. Исследование проб на содержание АПТ осуществляют или незамедлительно или после хранения при минус 20оС.

Характеристика трансформированных клеток СНО.

В чаши, содержащие среду с 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки, подают 0,2-0,3х106 клеток СНО/мл. В начале клетки очень медленно размножаются. По истечении 24-часового периода задержки начинается логарифмический рост клеток. При плотности 1,3+0,04х106 клеток/мл на четвертый день появляются первые нежизнеспособные клетки в культуре. Их доля от общего числа клеток составляет 13,2 ± 1,3% . Максимальная плотность клеток, достигаемая на пятый день, составляет 1,8 ± 0,05х106 клеток/мл. Число живых клеток по истечении 7 дней составляет еще 72 3% от общей массы клеток.

За экспоненциальным ростом клеток следует стационарная фаза, обусловленная различными факторами. Вследствие высокой плотности популяции и расхода существенных питательных веществ прекращается деление клеток. Продолжительность стационарной фазы может значительно меняться и зависит от компонентов среды, например, сыворотки. Накопление кислот и токсичных продуктов обмена вещества, а также изменения факторов среды, например, кислое значение рН, низкое парциальное давление кислорода, недостаточная аэрация, также вызывает отмирание клеток.

Производство АПТ в клетках СНО.

Временной ход производства АПТ включает 2 фазы. В первой фазе концентрация АПТ в надосадочной жидкости постоянно повышается. Во второй фазе синтез энзима практически прекращается и концентрация АПТ в среде остается почти постоянной. Максимальная концентрация АПТ на четвертый день составляет 11,1 ± 0,7 мкг/мл при анализе СИЭ. Внутриклеточное накопление АПТ проходит параллельно росту клеток и является относительно незначительной по сравнению с общим количеством полученного АПТ. На четвертый день ее доля составляет 7% общей активности.

Внутриклеточное содержание АПТ в пересчете на число клеток немного выше во время log-фазы и лежит между 500 и 900 нг АПТ/1х106 клеток, а начиная с четвертого дня количество АПТ составляет приблизительно 450 нг/1х106 клеток.

Влияние сыворотки и ее факторов в среде на рост клеток и производство АПТ в клетках СНО.

Готовят исходную культуру, содержащую 0,25х10 клеток/мл и различную концентрацию сыворотки.

Концентрация сыворотки ниже 5% в среде отрицательно влияет на деление клеток, влияние же на производительность только незначительное. Максимальное число клеток при 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки составляет 0,56 ± 0,03х106 клеток и максимум концентрации АПТ - 5,7 ± 0,5 мкг/мл. АПТ определяется с помощью анализа НХА [среднее значение стандартное отклонение, далее: "СО" n = 4] .

Культивация клеток в свободной от сыворотки среде.

Готовят свободную от сыворотки исходную культуру, содержащую клетки с плотностью 0,4-0,5х106/мл. Деление клеток имеет место до четвертого дня. Максимум живых клеток достигается также на четвертый день и составляет 1,0 ± 0,2х106 клеток/мл. Концентрация АПТ в надосадочной жидкости постоянно повышается до седьмого дня и ее максимум, определенный анализом СИЭ, составляет 13,6 ± 0, 54 мкг/мл. Синтез АПТ/клетку в свободной от сыворотки среде приблизительно такого же порядка, что и в содержащей сыворотку среде и составляет от 7,2 ± 3,6 до 10,3 ± 2,8 мкг/1х106 клеток (согласно методу СИЭ). Процентное содержание АПТ в свободной от сыворотки среде в пересчете не количество протеинов в надосадочной жидкости составляют от 10,9 ± 1,0 до 12,5 ± 1,4% . Определение содержания АПТ осуществляют методом СИЭ (среднее значение ± СО, n = 4).

В табл. 1 сведены данные по повышению производства АПТ в клетках СНО в среде 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки, вызываемому различными алифатическими монокарбоновыми кислотами. Все кислоты используют в концентрациях от 10 до 500 мМ. Оптимальное количество для всех монокарбоновых кислот лежит между 1 и 10 мМ. Все монокарбоновые кислоты задерживают рост клеток. Но зависимое от концентрации торможение первичного обмена веществ, приводящее к задержке роста клеток, перекрывается повышением синтеза АПТ. Данные в табл. 1 относится к 1 мл надосадочной жидкости и указаны в % по сравнению с контрольным опытом, в котором в качестве органического вещества используют гепарин и фактор роста эндотелиальных клеток (согласно прототипу) в той же концентрации, что и соответствующее вещество согласно изобретению (при этом гепарин и указанный фактор используют в соотношении 1: 1). Определение АПТ осуществляется по методу НХА (среднее значение СО; n = 3-24). Максимальное значение относится к индивидуальной пробе. В этом случае карбоновая кислота взята в количестве, указанном в скобках.

Среднее значение относится к нескольким производственным процессам в течение 3-4 дней, причем монокарбоновые кислоты добавляют в 0 день до 3 дня культурации, как это указано в табл. 2. Данные, относящиеся к индивидуальным пробам, приведены в скобках.

В табл. 3 представлено повышение образования АПТ в клетках СНО в среде с 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки, вызываемое карбоновыми кислотами с 2-4 атомами углерода в зависимости от дня их добавления после 48-часового роста клеток в среде с 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки. Концентрация масляной и изомасляной кислот составляет 1 мМ, а концентрация пропионовой кислоты и изовалериановой кислоты 5 мМ. Значения относятся к 1 мл надосадочной жидкости клеток и указаны в % по сравнению с контрольным опытом, проводимом описанным выше образом (среднее значение ± СО, n = 3-5). Для определения количества АПТ применяют метод НХА.

П р и м е р 2. Влияние солей масляной кислоты на производство АПТ в клетках СНО. Стимулирующий эффект выражается не только повышением внутриклеточной концентрации АПТ, но и повышением внеклеточной концентрации АПТ.

В табл. 4 указаны результаты стимуляции синтеза АПТ с помощью бутирата натрия в среде с 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки в пересчете на число клеток. Бутират натрия добавляют в концентрации 1 мМ в день 0. Результаты в дни 1-4 указаны в % по сравнению с проводимым вышеописанным образом контрольным опытом и относится к 1х106 клеток. Содержание АПТ в надосадочной жидкости и в экстракте клеток определяют с помощью анализа СИЭ (среднее значение ± СО, n = 5-10).

В табл. 5 сведены данные по повышению производства АПТ в клетках СНО, которые культивируют в среде с 7,5% эмбриональной телячьей сыворотке. 1 мМ бутирата натрия добавляют при каждой замене среды или же только в день 0. Результаты через 2, 4, 7 и 9 дней после замены среды указаны в % по сравнению с проводимым вышеописанным образом контрольным опытом и относятся к 1 мл надосадочной жидкости клеток. Определение количества АПТ осуществляют методом НХА (среднее значение ±СО, n = 3).

П р и м е р 3. Влияние солей масляной кислоты на производство АПТ в клетках СНО в свободной от сыворотки среде.

В противоположность к кратковременному эффекту стимуляции бутиратом натрия синтеза АПТ в содержащей сыворотку среде соответствующий эффект в свободной от сыворотки среде длится дольше и через 1 день после добавления бутирата натрия составляет 44,1 ± 7,1% по сравнению с контрольным опытом. Максимальное повышение, составляющее 143,3 ± 12,8% , достигает через 3 дня после добавления бутирата натрия. Эффект повышения выхода можно наблюдать еще через 6 дней после добавления бутирата натрия, он составляет 49,9 ± 7,0% (определение с помощью анализа СИЭ). Синтез АПТ в пересчете на 1х106 клеток в свободной от сыворотки среде также выше, чем в содержащей сыворотку среде, т. е. повышается от 9 мкг на второй день до 55 мкг в пересчете на 1х10 клеток на седьмой день (определение с помощью анализа СИЭ).

П р и м е р 4. Влияние нонактиновой кислоты с 10 атомами углерода и фуранжирной кислоты на производство АПТ в клетках СНО. Повышение производства АПТ в клетках СНО вышеуказанными кислотами представлено в табл. 6. Клетки культивируют в среде с 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки. Кислоты испытывают в пределах концентраций от 10 мкМ до 10 мМ, причем концентрация 1 мМ является оптимальной. Результаты относятся к 1 мл надосадочной жидкости клеток и указаны в % по сравнению с контрольным опытом (средние значения ± СО, n = 4-9). Максимальное значение относится к индивидуальной пробе. Выход АПТ определяют методом НХА.

х) формула Средние значения относятся к нескольким производственным процессам в течение 4 дней, причем кислоты добавляют в день 0.

П р и м е р 5. Влияние тиолов и сульфидов на производство АПТ в клетках СНО. Четыре серосодержащих соединения, представляющих собой производные или продукты замещения карбоновых кислот, обеспечивают повышение производства АПТ на 16% -31,2% без отрицательного влияния на рост клеток (табл. 7). Замещенные карбоновые кислоты проявляют оптимальное действие в тех же пределах концентраций (1-10 мМ), что и другие карбоновые кислоты. Только глютатион проявляет активность в более низких концентрациях (1-10 мкМ). Тиогликолевая кислота является наилучшим стимулятором синтеза АПТ в клетках СНО. В данном примере клетки культивируют в среде с 7,5% эмбриональной телячьей сыворотке. Все вещества испытывают в пределах концентраций от 1 мкМ до 10 мМ. Результаты опыта приведены в табл. 7, относятся к 1 мл надосадочной жидкости клеток и указаны в % по сравнению с контрольным опытом (средние значения ± СО, n = 6-19). Максимальное значение относится к индивидуальной пробе. Количество АПТ определяют методом НХА. Оптимальная концентрация вещества указана в скобках. Средние значения относятся к нескольким производственным процессам в течение 3 дней, причем вещества добавляют в дни 0-2. Преимущества тиокарбоновых кислот перед монокарбоновыми кислотами заключаются в отсутствии эффекта торможения пролиферации клеток, однако степень повышения производства АПТ этими веществами не превышает результатов, достигаемых в присутствии масляной кислоты. В свободной от сыворотки среде стимулирующее действие на синтез АПТ немного меньше, чем в содержащей сыворотку среде, так как все вещества незначительно тормозят деление клеток.

П р и м е р 6. Влияние тиогликолевой кислоты. После добавления тиогликолевой кислоты производство АПТ повышается в течение 72 ч. При этом процент повышения выхода протеинов является самым высоким по истечении 24 ч и затем непрерывно падает. В табл. 8 приведены данные по повышению производства АПТ в клетках СНО, которые культивируют в течение 24-96 ч в среде, содержащей 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки и 1 мМ тиогликолевой кислоты, в зависимости от дня добавления кислоты. Данные относится к 1 мл надосадочной жидкости клеток и указаны в % по сравнению с описанным выше контрольным опытом (средние значения ± СО, n = 4-6). Выход АПТ определяют методом НХА.

П р и м е р 7. Влияние бромида бутирилхолина (ББХ) и хлорида бутирилхолина (ХБХ) на производство АПТ в клетках СНО. В табл. 9 приведены данные по повышению производства АПТ в клетках СНО, получаемые при проведении процесса в присутствии вышеупомянутых производных масляной кислоты. Клетки культивируют в среде с 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки. Оба вещества испытывают в пределах концентраций от 10 мкМ до 10 мМ. Результаты опыта указаны в % по сравнению с контрольным опытом и относятся к 1 мл надосадочной жидкости клеток (средние значения ± СО n = 4-15). Результаты, относящиеся индивидуальным пробам, приведены в скобках. Максимальное значение относится к индивидуальной пробе. Выход АПТ определяют методом НХА. Средние значения относятся к нескольким производственным процессам в течение 4 дней.

П р и м е р 8. Влияние афидиколина на производство АПТ. Данные по повышению производства АПТ в среде, содержащей клетки СНО, 1 мкМ афидиколина и 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки, приведены в табл. 10. Они относятся к 1 мл надосадочной жидкости клеток и указаны в % по сравнению с вышеописанным контрольным опытом (средние значения ± СО, n = 4). Выход АПТ определяют методом НХА. Афидиколин в концентрации 1 мМ незначительно (5% ) тормозит рост клеток в течение 24 ч. После замены среды обработанные афидиколином культуры опять доводят до того же числа клеток, что и контрольные культуры. Концентрацию АПТ в свободной от сыворотки среде определяют методом СИЭ по истечении 96, 120 и 144 ч. Опыт проводят с использованием обработанных 1 мкМ афидиколина клеток СНО, которые предварительно культивируют в свободной от сыворотки среде. Данные относятся к 1 мл надосадочной жидкости клеток и указаны в % по сравнению с вышеописанным контрольным опытом (среднее значение СО, n = 4). Дополнительное использование в указанной системе масляной кислоты, пропионовой кислоты, хлорида бутирилхолина и бромида бутирилхолина приводит к дальнейшему повышению производства АПТ как в свободной от сыворотки среде, так и в богатой сывороткой среде. При этом эффект дополнительного повышения в свободной от сыворотки среде достигается только при добавлении вещества после 24-часового приспособления клеток к условиям бессывороточной среды. В табл. 11 сведено % -ное повышение производства АПТ в обработанных афидиколином культурах после добавления бутирата натрия. Бутират натрия повышает выход АПТ на дальнейшие 14% по истечении 96 ч. Опыт проводят в бессывороточной среде с использованием обработанных 1 мМ афидиколина клеток СНО, которые культивируют в присутствии бутирата натрия. Данные относятся к 1 мл надосадочной жидкости клеток и приведены в % по сравнению с вышеописанным контрольным опытом (средние значения ± СО, n = 4). Выход АПТ определяют методом СИЭ.

П р и м е р 9. Влияние 6-окиси-4,6-диметил-3-гептен-2-она (ДГО) на производство АПТ. Выход АПТ повышается через 144 ч после обработки вышеуказанным соединением. Для обеспечения стимуляции синтеза АПТ указанное соединение используют в концентрациях 0,005-100 мкМ. Повышение производства АПТ в клетках СНО, которые культивируют в течение 168 ч в свободной от сыворотки среде в присутствии 7 мМ - 7 мМ ДГО, в среднем оставляет 45,6 ± 3,6% (в пересчете на 1 мл надосадочной жидкости клеток; определение осуществляют методом СИЭ). Из культур клеток АПТ можно выделять известными приемами. Так, например, после производственной фазы питательную среду отделяют от клеточной массы и надосадочную жидкость клеток очищают путем ультрафильтрации и хроматографии. Выделяемый таким образом АПТ можно переводить в пригодные фармацевтические препараты, например, в раствор или лиофилизат.

П р и м е р 10. Повторяют пример 1 с той разницей, что используют молочную кислоту в концентрации 10 мкМ - 10 мМ или глицериновую кислоту в концентрации 10 мкМ - 10 мМ, или яблочную кислоту в концентрации 10 мкМ - 10 мМ, или аскорбиновую кислоту в концентрации 10 мМ. Результаты опыта сведены в табл. 12 (56) ЕР 0219270, кл. С 12 N 9/64, опублик. 1987.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения лекарственного препарата - активатора плазминогена ткани (АПТ). Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Культуру клеток СНО культивируют в присутствии органического вещества - пропионовой кислоты в концентрации 5 - 10 мм, или масляную кислоту, или ее натриевую соль в концентрации 1 - 5 мм, или изомасляную кислоту в концентрации 0,6 - 10 мм, или изовалериановую кислоту в концентрации 1 - 20 мм, или молочную кислоту в концентрации 10 мкМ - 10 мМ, или глицериновую кислоту в концентрации 10 мкМ - 10 мМ, или яблочную кислоту в концентрации 10 мкМ - 10 мМ, или тиодигликолевую кислоту в концентрации 1 мМ, или аскорбиновую кислоту в концентрации 10 мМ, или нонактиновую кислоту в концентрации 10 мкМ - 10 мМ, или фуранжирную кислоту в концентрации 10 мкМ - 10 мМ, или тиогликолевую кислоту в концентрации 1 мМ, или - L-цистеин в концентрации 1 - 10 мМ, или глютатион в концентрации - 1 - 10 мкМ, или бутирилхинолинбромид или бутирилхолинхлорид в концентрации 5 - 10 мМ, или афидиклоин в концентрации 1 мкМ, или 6-окси-4,6-диметил-3-гептен-2-он в концентрации 7 мкМ - 7 мМ, или винную кислоту в концентрации 10 мМ. 12 табл.

Формула

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА ТКАНИ путем культивирования культуры клеток СНО в присутствии органического вещества с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве органического вещества используют пропионовую кислоту в концентрации 5 - 10 мМ, или масляную кислоту, или ее натриевую соль в концентрации 1 - 5 мМ, или изомасляную кислоту в концентрации 0,6 - 10 мМ, или изовалериановую кислоту в концентрации 1 - 20 мМ, или молочную кислоту в концентрации 10 мкМ - 10 мМ, или глицериновую кислоту в концентрации 10 мкМ - 10 мМ, или яблочную кислоту в концентрации 10 мкМ - 10 мМ, или тиодигликолевую кислоту в концентрации 10 мМ, или аскорбиновую кислоту в концентрации 10 мМ, или нонактиновую кислоту в концентрации 10 мкМ - 10 мМ, или фуранжирную кислоту в концентрации 10 мкМ - 10 мМ, или тиогликолевую кислоту в концентрации 1 мМ, или L-цистеин в концентрации 1 - 10 мМ, или глютатион в концентрации 1 - 10 мкМ, или бутирилхинолинбромид или бутирилхолинхлорид в концентрации 5 - 10 мМ, или афидиклоин в концентрации 1 мкМ, или 6-окси-4,6-диметил-3-гептен-2-он в концентрации 7 мкМ - 7 мМ, или винную кислоту в концентрации 10 мМ.

Авторы

Патентообладатели

Заявители

СПК: C12N1/38 C12N5/0018 C12N9/6459 C12N2500/36 C12Y304/21069

Публикация: 1994-01-15

Дата подачи заявки: 1988-10-13

0
0
0
0
Невозможно загрузить содержимое всплывающей подсказки.
Поиск по товарам