Штамм бактерий methylophilus methylotrophus - продуцент l-фенилаланина (варианты), способ получения l-фенилаланина - RU2202607C2

Описание

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение имеет отношение к способу получения L-фенилаланина, в частности к бактерии, принадлежащей к роду Methylophilus и обладающей способностью к продукции L-фенилаланина, и способу получения L-фенилаланина с использованием бактерии, принадлежащей к роду Methylophilus.

Известны способы получения L-фенилаланина методом ферментации с использованием микроорганизмов, таких как рекомбинантные бактерии, принадлежащие к роду Escherichia (выложенные патентные заявки Японии 56-1890, 57-170184, 58-103398, 61-92565, 1-104160 и международная заявка WO 87/00202). Известны способы получения L-фенилаланина и L-тирозина с использованием мутантов, принадлежащих к роду Corynebacterium (выложенная патентная заявка Японии 61-128897), и рекомбинантных бактерий, принадлежащих к роду Corynebacterium (выложенные патентные заявки Японии 60-34197, 60-24192, 61-260892 и 61-124375).

Однако способ получения L-фенилаланина с использованием бактерии, принадлежащей к роду Methylophilus, не известен.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является получение бактерии, обладающей способностью к продукции L-фенилаланина, и разработка способа получения L-фенилаланина с использованием бактерии.

Авторы настоящего изобретения установили, что бактерия, принадлежащая к роду Methylophilus и обладающая устойчивостью к аналогу фенилаланина, способна продуцировать L-фенилаланин. На основании этих полученных данных настоящее изобретение было совершено.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию, принадлежащую к роду Methylophilus, которая обладает способностью к продукции L-фенилаланина и устойчивостью к аналогу фенилаланина (здесь и далее упоминаемая как "бактерия согласно настоящему изобретению").

Бактерия согласно настоящему изобретению устойчива предпочтительно к аналогу фенилаланина и L-фенилаланину.

Бактерия согласно настоящему изобретению устойчива предпочтительно к DL-п-фторфенилаланину.

Бактерия согласно настоящему изобретению была предпочтительно получена селекцией штамма, устойчивого к аналогу фенилаланина и L-фенилаланину, среди бактерий, принадлежащих к роду Methylophilus, в случае, когда указанная селекция производилась по крайней мере один раз как для аналога фенилаланина, так и для L-фенилаланина в любой последовательности.

Бактерия согласно настоящему изобретению устойчива более предпочтительно к DL-п-фторфенилаланину и м-фторфенилаланину, так же как и к L-фенилаланину.

Бактерия согласно настоящему изобретению была более предпочтительно получена селекцией штамма, устойчивого к DL-п-фторфенилаланину, м-фторфенилаланину и L-фенилаланину среди бактерий, принадлежащих к роду Methylophilus, в случае, когда указанная селекция производилась по крайней мере один раз для DL-п-фторфенилаланина, м-фторфенилаланина и L-фенилаланина в любой последовательности.

Бактерия согласно настоящему изобретению устойчива предпочтительно к DL-п-фторфенилаланину, м-фторфенилаланину и коричной кислоте, так же как и к L-фенилаланину.

Бактерия согласно настоящему изобретению была более предпочтительно получена селекцией штамма, устойчивого к DL-п-фторфенилаланину, м-фторфенилаланину, коричной кислоте и L-фенилаланину среди бактерий, принадлежащих к роду Methylophilus, в случае, когда указанная селекция производилась по крайней мере один раз для DL-п-фторфенилаланина, м-фторфенилаланина, коричной кислоты и L-фенилаланина в любой последовательности.

Бактерией согласно настоящему изобретению предпочтительно является Methylophilus methylotrophus.

Настоящее изобретение также предоставляет способ получения L-фенилаланина, включающий стадии:
выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-фенилаланина в питательной среде, и
выделения L-фенилаланина из питательной среды (здесь и далее упоминаемый как "способ согласно настоящему изобретению").

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Бактерия согласно настоящему изобретению
Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Methylophilus, обладающая способностью к продукции L-фенилаланина и устойчивостью к аналогу фенилаланина, предпочтительно к аналогу фенилаланина и L-фенилаланину.

Бактерия Methylophilus methylotrophus относится к бактериям, принадлежащим к роду Methylophilus.

Способность к продукции L-фенилаланина означает способность накапливать значительное количество L-фенилаланина в питательной среде при выращивании бактерии в питательной среде. Обычно это означает способность к накоплению L-фенилаланина в концентрации не менее 0,5 г/л в условиях, описанных в примерах, указанных ниже.

Примерами аналогов фенилаланина являются DL-п-фторфенилаланин, м-фторфенилаланин, β-амино-β -фенилпропионовая кислота, о-фторфенилаланин, β-2-тиэнилаланин, β-3-тиэнилаланин, β-2-фурилаланин, β-3-фурилаланин, о-аминофенилаланин, п-аминофенилаланин, м-аминофенилаланин, α-амино-β-фенилэтансульфонат, β-2-пирролаланин, 1-циклогексен-1-аланин, β-4-пиридилаланин, β-4-пиразолилаланин, п-нитрофенилаланин, циклогексилаланин, о-хлорфенилаланин, м-хлорфенилаланин, п-хлорфенилаланин, о-бромфенилаланин, м-бромфенилаланин, п-бромфенилаланин, β-4-тиазолаланин и подобные соединения.

Устойчивость к аналогу фенилаланина означает то, что бактерия может расти в присутствии такого количества аналога фенилаланина, при котором штамм дикого типа (например, штамм AS-1) не может расти. Это количество варьируется в зависимости от типа аналога фенилаланина. В случае DL-п-фторфенилаланина это обычно 2 г/л в условиях, описанных в указанных ниже примерах, а в случае м-фторфенилаланина это обычно 1 г/л в условиях, описанных в указанных ниже примерах.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была устойчива по крайней мере к аналогам фенилаланина двух типов. Например, предпочтительно, чтобы она была устойчива к DL-п-фторфенилаланину и м-фторфенилаланину.

Устойчивость к L-фенилаланину означает то, что бактерия может расти в присутствии такого количества L-фенилаланина, при котором штамм дикого типа (например, штамм AS-1) не может расти. Это количество составляет обычно 8 г/л в условиях, описанных в указанных ниже примерах.

Бактерия согласно настоящему изобретению устойчива предпочтительно к высокой концентрации (например, 0,1 М) L-фенилаланина.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания требуемой множественной устойчивости бактерии, принадлежащей к роду Methylophilus, в некоей очередности. Очередность придания устойчивости к аналогам фенилаланина и L-фенилаланину не является строго определенной и может быть осуществлена в любой последовательности.

Метод получения бактерии, принадлежащей к роду Methylophilus и устойчивой к аналогу фенилаланина, и бактерии, принадлежащей к роду Methylophilus и устойчивой к L-фенилаланину, будет разъяснен ниже.

Бактерия, принадлежащая к роду Methylophilus и устойчивая к аналогу фенилаланина, может быть получена выращиванием бактерии, принадлежащей к роду Methylophilus, на минимальной среде, содержащей аналог фенилаланина в ингибирующей рост концентрации, и отбором растущих штаммов.

Селекция штаммов, устойчивых к аналогу фенилаланина, может быть проведена с одним типом аналога фенилаланина или с их большим числом.

Селекция штаммов может быть проведена один раз или более для одного типа аналога фенилаланина.

Количество аналога фенилаланина, которое необходимо добавить в питательную среду, зависит от типа аналога фенилаланина, но предпочтительно, чтобы его количество было не менее 2 г/л в случае DL-п-фторфенилаланина. Бактерия, принадлежащая к роду Methylophilus, перед селекционным отбором может быть подвергнута обработке с целью получения мутации. Мутация может быть вызвана УФ облучением или обработкой мутагенным соединением, обычно используемым для искусственного мутагенеза, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (NTG), азотистой кислотой или подобным соединением.

Бактерия, принадлежащая к роду Methylophilus и устойчивая к L-фенилаланину, может быть получена выращиванием бактерии, принадлежащей к роду Methylophilus, на минимальной среде, содержащей L-фенилаланин в ингибирующей рост концентрации, и отбором растущих штаммов. В данном случае ингибирование роста соответствует медленному росту или остановке роста. Селекция штаммов может быть осуществлена один раз или более. Концентрация L-фенилаланина в питательной среде не ограничена особым образом, но, например, не опускается ниже 0,05 М, предпочтительно 0,1 М. Бактерия, принадлежащая к роду Methylophilus, перед селекционным отбором может быть подвергнута обработке с целью получения мутации способом, описанным выше.

Полученная описанным выше способом бактерия, принадлежащая к роду Methylophilus и устойчивая к L-фенилаланину, может расти в присутствии такой концентрации L-фенилаланина, при которой исходный родительский штамм расти не может.

Бактерия согласно настоящему изобретению предпочтительно устойчива к коричной кислоте.

Устойчивость к коричной кислоте означает то, что бактерия может расти в присутствии такого количества коричной кислоты, при котором штамм дикого типа (например, штамм AS-1) не может расти. Это количество составляет обычно 50 мг/л в условиях, описанных в указанных ниже примерах.

Бактерия, принадлежащая к роду Methylophilus и обладающая устойчивостью к коричной кислоте, может быть получена способом, аналогичным способу получения бактерий, устойчивых к аналогу фенилаланина. Очередность придания устойчивости к коричной кислоте, аналогам фенилаланина и L-фенилаланину не является строго определенной и может быть осуществлена в любой последовательности.

L-Фенилаланин имеет отношение к нескольким стадиям регулирования своего биосинтеза. Вследствие этого, единичная мутация, приводящая к устойчивости к L-фенилаланину, может быть полезной для увеличения продуктивности L-фенилаланина, однако предпочтительно, чтобы утрата регулирования была вызвана двумя или большим числом мутаций.

Бактерия, принадлежащая к роду Methylophilus, которая содержит единичную мутацию, может быть использована в качестве источника для выведения штамма, продуцирующего L-фенилаланин, даже если ее продуктивность L-фенилаланина является низкой.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена в отношении активности одного или более ферментов, участвующих в биосинтезе L-фенилаланина, путем обычной обработки с целью получения мутаций или с помощью методов генной инженерии.

Например, биосинтез L-фенилаланина может быть усилен путем увеличения способности к продукции фосфоенолпирувата в бактерии, принадлежащей к роду Methylophilus (международная заявка WO 97/08333).

Продукция L-фенилаланина усиливается при использовании улучшенного, утратившего чувствительность гена хоризмат мутазы - префенат дигидратазы (выложенные патентные заявки Японии 5-236945 и 62-130693) и/или утратившего чувствительность гена ((3-дезокси-D-арабино-гептулозоновая кислота)-7-фосфат)-синтазы (выложенные патентные заявки Японии 5-236945 и 62-124375).

Способ согласно настоящему изобретению
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-фенилаланина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-фенилаланина в питательной среде и извлечения L-фенилаланина из питательной среды.

Выращивание бактерии согласно настоящему изобретению может быть осуществлено способом, обычно используемым для выращивания усваивающих метанол микроорганизмов. Питательная среда, использованная в настоящем изобретении, может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что она содержит источники углерода, азота, минеральные вещества и, если необходимо, другие органические микродобавки.

L-Фенилаланин может быть получен недорогим способом, если в качестве источника углерода использовать метанол. Обычно метанол добавляют в питательную среду в количестве от 0,001 до 30 вес.%, если он используется в качестве основного источника углерода. В качестве источника азота может быть использован сульфат аммония, добавленный в питательную среду. В дополнение к этому, используется небольшое количество минеральных веществ, таких как фосфат калия, фосфат натрия, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца.

Выращивание обычно проводят при значении рН от 5 до 9 и температуре от 20 до 40^oС в аэробных условиях, таких как встряхивание культуры, аэрация и перемешивание. Обычно процесс проводят в течение от 24 до 120 ч.

Культура содержит клетки и питательную среду, но главным образом - питательную среду.

Извлечение L-фенилаланина из культуры может быть осуществлено комбинацией известных методов, таких как метод очистки на ионообменной смоле и метод осаждения.

ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение подробно описано в приведенных примерах. Способы выращивания Methylophilus methylotrophus и анализа L-фенилаланина, использовавшиеся в приведенных примерах, следующие:
Выращивание в пробирках.

1. Посевная культура
Штамм был выращен на чашках или в пробирках со скошенной средой 121 (Fe2) с агаром, содержащей 1% метанола при 30^oС в течение 48-72 ч. Затем штамм был пересажен в 5 мл среды 121 (Fe2), содержащей 2% метанола, использовавшейся затем в качестве исходной культуры для пробирок емкостью 40 мл. Посевная культура инкубировалась во вращающейся мешалке при 37^oС в течение 18 ч.

2. Ферментация в пробирках
Выращивание продуцента L-фенилаланина проводилось при 37^oС в 5 мл среды 121 (Fe2), содержащей 2% метанола и 3% карбоната кальция в пробирках емкостью 40 мл. Через 24 ч после начала выращивания дополнительная порция 2% метанола была добавлена и выращивание было продолжено в течение еще 48 ч при 37^oС во вращающейся мешалке.

Состав среды 121 (Fe2) (1 л):
К₂НРO₄• 3Н₂О - 1,57 г
К₂НРO₄ - 0,62 г
(NH₄)₂SO₄ - 3 г
NaCl - 0,1 г
MgSO₄•7H₂O - 0,2 г
CaCl₂ - 0,025 г
ЭДТА-Nа₂ - 5 мг
FeSO₄•7H₂O - 3 мг
MnSO₄•5H₂O - 0,01 мг
ZnSO₄•7H₂O - 0,07 мг
Na₂MoO₄•2H₂O - 0,01 мг
Н₃ВО₃ - 0,01 мг
CoCl₂ •6H₂O - 0,005 мг
CuSO₄•5H₂O - 0,005 мг
Метанол - 20 мл (стерилизованный фильтрованием)
СаСО₃ - 30 г - рН 7,0
Начальный объем среды в пробирках для ферментации: 5 мл.

Аликвота посевной культуры: 10%/
Температура: 37^oС.

Перемешивание: 250 оборотов в минуту.

Анализ L-фенилаланина в ферментационном бульоне
1. Приготовление образцов
Образцы ферментационной среды были отцентрифугированы в течение 15 минут в микроцентрифуге модели 5415С (Eppendorf) для удаления клеток и их остатков. Супернатант был использован для анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2. Хроматографическое определение L-фенилаланина
Система для хроматографии состояла из насоса для ВЭЖХ модели 30 (Gilson) и детектора с изменяемой длиной волны модели 2151 (LKB), установленного на 245 нм. Образцы вводились с использованием инжектора с внутренней петлей объемом 1 мкл модели 7410 (Rheodyne). Температура колонки поддерживалась при 45^oС с помощью термостата с водяной рубашкой собственной конструкции.

Для всех разделений использовалась система стеклянных колонок размером 150х3,9 мм (внутренний диаметр), наполненных сорбентом 5 мкм Separon С18 (Tessek). Элюент состоял из 0,001 М водного раствора CuSO₄ и ацетонитрила (80:20 по объему).

Образцы ферментационного бульона были отцентрифугованы 5 минут при 13000 g и введены без дальнейшей очистки.

Данные обрабатывались с помощью совместимой с IBM/AT станции с интерфейсом модели 960 и программным обеспечением Nelson PC Integrator (PE Nelson). Пики обсчитывались с использованием метода внешнего стандарта.

Пример 1. Конструирование мутантного штамма Methylophilus methylotrophus, обладающего способностью к продукции L-фенилаланина.

Мутагенез и селекция мутантов, устойчивых к DL-п-фторфенилаланину - аналогу ароматических аминокислот.

Штамм Methylophilus methylotrophus AS-1 (NCIB 10515; АТСС 53528) был протестирован на предмет чувствительности к DL-п-фторфенилаланину - аналогу ароматических аминокислот. Чувствительность проверялась на среде 121 (Fe2) с агаром, содержащей разные концентрации DL-п-фторфенилаланина. 10⁸ бактерий/мл М. methylotrophus было перенесено на чашку и оставлено для роста при 30^oС в течение 3 дней. 1 мг/мл DL-п-фторфенилаланина полностью ингибировал рост бактерий. Для отбора мутантов, устойчивых к аналогу, 10⁸ бактерий штамма М. methylotrophus были высажены на чашку, содержащую 2 мг/мл DL-п-фторфенилаланина. Несколько кристаллов мутагена N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина (здесь и далее - NG) были помещены в центр чашки. По истечении 4-5 дней при 30^oС чашки были проанализированы. Рядом с мутагеном NG бактерии не росли, но на расстоянии 3-4 см от него росли колонии мутантов, устойчивых к аналогу. Большие колонии были собраны и очищены на такой же среде с DL-п-фторфенилаланином. Были выращены мутанты М. methylotrophus, устойчивые к DL-п-фторфенилаланину (здесь и далее обозначаемые как pFp^R), и измерена концентрация L-фенилаланина в ферментационной среде так, как описано выше. Наилучший мутант М. methylotrophus pFp^R 227 производил 30 мг/л L-фенилаланина, около 1 г/л L-валина и 0,2 г/л L-лейцина, L-изолейцина и L-аланина. Данные тонкослойной хроматографии подтвердили результаты ВЭЖХ.

Мутагенез и селекция мутантов Methylophilus methylotrophus, устойчивых к высокой концентрации L-фенилаланина в среде для роста.

Мутанты Methylophilus methylotrophus, устойчивые к DL-п-фторфенилаланину, продуцировали L-фенилаланин, но были чувствительны к высокой концентрации L-фенилаланина, если он присутствовал в питательной среде. L-Фенилаланин в концентрации 0,1 М, добавленный в среду 121 с агаром, полностью ингибировал рост мутанта М. methylotrophus pFp^R 227.

С целью удаления такой чувствительности и повышения продуктивности штамма были отобраны мутанты, устойчивые к высокой концентрации L-фенилаланина, присутствовавшего в среде для роста. В качестве исходного штамма для селекции мутантов, устойчивых к L-фенилаланину (здесь и далее обозначаемых как phe^R), был использован штамм М. methylotrophus 227 (мутантный штамм pFp^R), продуцирующий небольшое количество (30 мг/л) L-фенилаланина. Питательная среда для селекции представляла собой среду 121(Fe2) с агаром, содержащую 1% метанола и 0,05 М L-фенилаланина. Мутагенез был осуществлен с помощью NG, как описано выше. Колонии мутантов, устойчивых к L-фенилаланину, были очищены несколько раз на среде для селекции и затем на среде без 0,05 М L-фенилаланина. Маркер phe^R был унаследован стабильно и не терялся без селекционного давления. Отобранные мутанты М. methylotrophus pFp^R phe^R были выращены и измерена концентрация L-фенилаланина в ферментационной среде, как это описано выше. Наилучший мутант М. methylotrophus pFp^R рhe^R 227-16, содержащий мутацию, придающую устойчивость к высокой концентрации L-фенилаланина, продуцировал 0,4 г/л L-фенилаланина. Таким образом, мутация phe^R, являющаяся второй мутацией в мутанте М. methylotrophus pFp^R phe^R 227-16, приводила к повышению продукции L-фенилаланина более чем в 10 раз: мутант pFp^R ( 227) продуцировал 30 мг/г L-фенилаланина, а двойной мутант pFp^R phe^R ( 227-16) продуцировал 400 мг/л L-фенилаланина.

Было установлено, что штамм мутанта М. methylotrophus pFp^R phe^R 227-16 кроме устойчивости к 2 г/л DL-п-фторфенилаланина и 0, 05 М L-фенилаланина обладал также устойчивостью 0,5 г/л м-фторфенилаланина. Однако штамм 227-16 рос слабо в среде с 1 г/л м-фторфенилаланина. Новые мутанты, устойчивые 1 г/л м-фторфенилаланина (здесь и далее обозначаемые как mFp^R), были получены из штамма 227-16 после мутагенеза с помощью NG, как описано выше. Полученный новый мутантный штамм М. methylotrophus pFp^R phe^R mFp^R 227-16-10 продуцировал такое же количество L-фенилаланина, как и его предшественник (0,4 г/л).

Новый мутантный штамм М. methylotrophus pFp^R phe^R mFp^R phe^RR 227-16-10-11, устойчивый к более высокой концентрации L-фенилаланина (0,1 М) (здесь и далее обозначаемый как phe^RR), был выведен из штамма 227-16-10 после мутагенеза с помощью NG как описано выше. Мутантный штамм phe^RR продуцировал в пробирках 0,5-0,7 г/л L-фенилаланина, 0,3 г/л L-валина, 0,2 г/л L-лейцина и менее чем 0,1 г/л L-изолейцина, L-аланина, L-глутаминовой кислоты.

Новый мутантный штамм М. methylotrophus pFp^R phe^R mFp^R phe^RR cin^R 227-16-10-11-cin8, устойчивый к коричной кислоте (50 мг/л), являющейся химическим структурным аналогом L-фенилаланина (здесь и далее обозначаемый как cin^R), был выведен из штамма 227-16-10-11 после мутагенеза с помощью NG, как описано выше. Мутантный штамм продуцировал в пробирках 0,8-0,9 г/л L-фенилаланина и 0,6 г/л L-валина.

Штаммы 227, 227-16, 227-16-10, 227-16-10-11 и 227-16-10-11-cin8 были депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) 10-го февраля 2000 г. с коллекционными номерами ВКПМ В-7909, ВКПМ В-7910, ВКПМ В-7911, ВКПМ В-7912 и ВКПМ В-7913, соответственно.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, а в частности к способу получения L-фенилаланина. Предложены новые штаммы Methylophilus methylotrophus, которые обладают устойчивостью к одному или нескольким аналогам фенилаланина и L-фенилаланину и способны к продукции L-фенилаланину. Также предложен способ получения L-фенилаланина, предусматривающий культивирование новых штаммов Methylophilus methylotrophus на питательной среде с последующим выделением L-фенилаланина из питательной среды. Предложенный способ получения L-фенилаланина, с использованием новых штаммов Methylophilus methylotrophus, позволяет повысить выход целевого продукта. 6 с. и 1 з.п. ф-лы.

Формула