Способ получения 1,3-пропандиола путем ферментации рекомбинантного микроорганизма - RU2757790C1

Чертежи

Описание

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области генной инженерии или биологической ферментации, а именно к способу эффективного биопревращения сбраживаемого углевода в 1,3-пропандиол с использованием одного рекомбинантного микроорганизма без добавления витамина B12.

Уровень техники

1,3-пропандиол является важным химическим сырьем и может быть использован в качестве органического растворителя во многих отраслях промышленности, таких как производство чернил, полиграфическая промышленность и производство красителей, лакокрасочная промышленность, производство смазочных материалов и/или антифризов. Главной особенностью 1,3-пропандиола является то, что он может быть использован в качестве мономера для синтеза полиэфира и полиуретана. В частности, 1,3-пропандиол может быть использован для получения политриметилентерефталата (РТТ) посредством реакции полимеризации с терефталевой кислотой. По сравнению с полиэтилентерефталатом (PЕТ) или полибутилентерефталатом (PBT), PTT обладает лучшими свойствами по множеству аспектов, таких как повышенная резистентность к загрязнению, ударная вязкость, упругое восстановление после деформации и устойчивость к ультрафиолетовому излучению, а также износостойкость, низкое водопоглощение и/или вырабатывание низкого статического электричества. Таким образом, PTT рассматривается как продукт PЕТ улучшенного качества и имеет широкие коммерческие перспективы.

В настоящее время, методами получения 1,3-пропандиола, в основном, являются химические и биологические методы. В химических методах, 1,3-пропандиол может быть синтезирован посредством сложного каталитического процесса с использованием пропиленоксида или пропилена в качестве исходного материала. Недостатками методов химического синтеза являются избыточное количество побочных продуктов, низкая селективность, условия работы, требующие высоких температур и высокого давления, огромные инвестиции в оборудование и невозобновляемость сырьевых ресурсов. Поэтому, от химических методов производства 1,3-пропандиола пришлось отказаться.

Биологические методы получения 1,3-пропандиола включают два основных технических протокола, один из которых заключается в получении 1,3-пропандиола с помощью природного микроорганизма с использованием глицерина в качестве сырья, а второй заключвется в получении 1,3-пропандиола с помощью рекомбинантного микроорганизма с использованием глюкозы в качестве сырья. Оба эти метода описаны ниже.

В одном техническом протоколе, 1,3-пропандиол получают с использованием глицерина качестве сырья с помощью природного микроорганизма, такого как Klebsiella pneumoniae, Clostridium butyricum или Citrobacter freundii, которые могут превращать глицерин в 1,3-пропандиол в анаэробных или микроаэробных условиях. Основными недостатками этого технического способа являются: 1. Строгий контроль за биологической безопасностью, который необходимо соблюдать при получении 1,3-пропандиола, поскольку бактерия Klebsiella pneumoniae, которая обычно используется, представляет собой кондиционированный патоген; 2. Синтез большого количества побочных продуктов, таких как уксусная кислота, молочная кислота, янтарная кислота и 2,3-бутандиол, который в значительной степени усложняет все последующие стадии экстракции; 3. Сильные колебания стоимости глицерина на коммерческом рынке.

Другим известным методом является получение 1,3-пропандиола с использованием глюкозы в качестве сырья с помощью рекомбинантных микроорганизмов. Так, например, специалисты DuPont осуществляют одну стадию превращения глюкозы в 1,3-пропандиол посредством экзогенной экспрессии пути синтеза глицерина (глицерин-3-фосфат-дегидрогеназы и глицерин-3-фосфатазы) из Saccharomyces cerevisiae, а также глицерин-дегидратазы и его активирующих факторов, происходящих от Klebsiella pneumoniae, в E.coli вместе с NADPH-зависимой алкогольдегидрогеназой YqhD, происходящей от E. coli (CN 200380104657.2). Недостаток этого способа заключается в том, что глицериндегидратаза требует наличия кофермента B12 в качестве кофактора, который не может синтезироваться E.coli, а поэтому в процессе ферментации необходимо добавлять дорогостоящий витамин B12, что значительно увеличивет расходы на производство и является невыгодным для промышленного и крупномасштабного производства.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка нового способа прямого превращения сбраживаемого углевода в 1,3-пропандиол с использованием рекомбинантного микроорганизма, где указанный способ имеет низкую себестоимость и не требует добавления дорогостоящего витамина B12.

Во-первых, настоящее изобретение относится к рекомбинантному микроорганизму, способному сверхэкспрессировать:

(1) гены ацетил-CoA-карбоксилазы accBC и accDA;

(2) ген малонил-СоА-синтетазы mcr;

(3) ген 3-гидроксипропионил-CoA-синтетазы pcs;

(4) ген 3-гидроксипропионил-СоА-редуктазы pduP; и

(5) ген 1,3-пропандиолоксидоредуктазы yqhD.

Специалистам в данной области известно, что микроорганизмы согласно изобретению могут представлять собой стандартные микроорганизмы-модели, включая, но не ограничиваясь ими, E. coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis или Saccharomyces cerevisiae.

Рекомбинантный микроорганизм согласно изобретению может экспрессировать гены ацетил-СоА-карбоксилазы accBC и accDA, нуклеотидные последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно.

В примерах настоящего изобретения, гены ацетил-СоА-карбоксилазы accBC и accDA происходят от Corynebacterium glutamicum.

Кроме того, рекомбинантный микроорганизм согласно изобретению может экспрессировать ген малонил-СоА-синтетазы mcr, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO.3. В примерах настоящего изобретения, ген малонил-СоА-синтетазы mcr происходит от Chloroflexus aurantiacus.

Кроме того, рекомбинантный микроорганизм согласно изобретению может экспрессировать ген 3-гидроксипропионил-СоА-синтетазы pcs, ген 3-гидроксипропионил-CoA-редуктазы pduP и ген 1,3-пропандиолоксидоредуктазы yqhD. В примерах настоящего изобретения, ген 3-гидроксипропионил-СоА-синтетазы pcs происходит от Metallosphaera sedula, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 4; ген 3-гидроксипропионил-CoA-редуктазы pduP происходит от Klebsiella pneumoniae, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 5, а ген 1,3-пропандиолоксидоредуктазы yqhD происходит от E.coli, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 6. Специалистам в данной области очевидно, что описание настоящего изобретения не ограничивается ферментами штаммов, описанных с Примерах, и что любой фермент, происходящий от других источников, имеющих такую же функцию, может также давать аналогичные технические эффекты.

В примерах настоящего изобретения, рекомбинантный микроорганизм был получен следующими способами:

(1) присоединения гена accBC, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 1, и гена accDA, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 2, к плазмиде pACYCDuet с получением рекомбинантной плазмиды pACYC-accDABC;

(2) присоединения фрагмента mcr размером 3,7 т.п.о., полученного путем ПЦР-амплификации с использованием нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3 в качестве матрицы и с использованием серии праймеров, представленных в SEQ ID NO: 11-12, к плазмиде pACYC-accDABC с получением рекомбинантной плазмиды pACYC-accDABC-mcr; а затем переноса этой рекомбинантной плазмиды в E. coli с получением рекомбинантного штамма E.coli/pACYC-accDABC-mcr после скрининга;

(3) присоединения фрагмента pcs размером 2,0 т.п.о., полученного путем ПЦР-амплификации с использованием нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 в качестве матрицы и с использованием серии праймеров, представленных в SEQ ID NO: 13-14, фрагмента pduP SEQ ID NO: 5 и фрагмента yqhD SEQ ID NO: 6 к плазмиде pET28 с получением рекомбинантной плазмиды pET-pcs-pduP-yqhD;

(4) переноса pET-pcs-pduP-yqhD в рекомбинантный штамм E.coli/pACYC-accDABC-mcr, полученный в стадии (2), с образованием рекомбинантного штамма E.coli/pACYC-accDABC-mcr/pET-pcs-pduP-yqhD после скрининга, где указанный штамм представляет собой рекомбинантный микроорганизм согласно изобретению.

Настоящее изобретение относится к применению рекомбинантного микроорганизма для получения 1,3-пропандиола.

Настоящее изобретение относится к способу получения 1,3-пропандиола путем ферментации с использованием рекомбинантного микроорганизма, где указанный способ включает стадии:

(1) конструирования рекомбинантного микроорганизма, способного сверхэкспрессировать гены ацетил-СоА-карбоксилазы accBC и accDA, ген малонил-СоА-синтетазы mcr, ген 3-гидроксипропионил-СоА-синтетазы pcs, ген 3-гидроксипропионил-CoA-редуктазы pduP и ген 1,3-пропандиолоксидоредуктазы yqhD; и

(2) проведения аэробной ферментации с использованием исходного материала, содержащего сбраживаемый углевод в качестве субстрата, без необходимости добавления витамина B12.

Сырьем, содержащим сбраживаемый углевод на стадии (2), является меласса, сахароза, глюкоза, гидролизат крахмала, кукурузный сироп, ксилоза, манноза или глицерин.

Условия ферментации на стадии (2): 28-37°C, значение рН в пределах от 5 до 8, и значение растворенного кислорода более, чем 10%.

Предпочтительные условия ферментации на стадии (2) составляют: 30-37°C, значение рН в пределах от 6 до 7, и значение растворенного кислорода более, чем 10%.

Субстрат для ферментации на стадии (2) также содержит Na₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄, NaCl, дрожжевой экстракт, NH₄Cl, гидрохлорид тиамина и биотин.

Настоящее изобретение относится к пути синтеза 1,3-пропандиола, как показано на фиг. 1: сначала, ацетил-СоА продуцируется из глюкозы (или из другого сбраживаемого углевода) по пути гликолиза в самом микроорганизме; ацетил-CoA продуцирует малонил-CoA в результате катализа ацетил-CoA-карбоксилазы; малонил-CoA продуцирует полуальдегид малоната в результате катализа малонил-CoA-редуктазы; полуальдегид малоната продуцирует 3-гидроксипропионат в результате катализа малонат-полуальдегид-редуктазы; 3-гидроксипропионат продуцирует 3-гидроксипропионил-CoA в результате катализа 3-гидроксипропионил- кофермент А-синтазы; 3-гидроксипропионил-CoA продуцирует 3-гидроксипропаналь в результате катализа 3-гидроксипропионил-CoA-редуктазы, а 3-гидроксипропаналь продуцирует 1,3-пропандиол в результате катализа 1,3-пропандиолоксидоредуктазы.

В соответствии с настоящим изобретением, 1,3-пропандиол получают путем ферментации в колбе или ферментере с использованием глюкозы в качестве субстрата с помощью рекомбинантного микроорганизма, способного сврехэкспрессировать гены ацетил-СоА-карбоксилазы accBC и accDA, ген малонил-СоА-синтетазы mcr, ген 3-гидроксипропионил-CoA-синтетазы pcs, ген 3-гидроксипропионил-CoA-редуктазы pduP и ген 1,3-пропандиолоксидоредуктазы yqhD. Во время ферментации, рекомбинантный микроорганизм согласно изобретению может утилизовать дешевую глюкозу в качестве сырья, при этом отсутствует необходимость в добавлении дорогостоящего витамина B12, что позволяет значительно снизить стоимость производства такого продукта и открывает широкие рыночные перспективы. Способ согласно изобретению является простым, не требует значительных затрат, позволяет получить 1,3-пропандиол с высоким выходом и минимальным числом побочных продуктов, и является подходящим для дальнейшего упрощения процесса выделения 1,3-пропандиола.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена блок-схема способа получения 1,3-пропандиола путем ферментации глюкозы с использованием рекомбинантного микроорганизма согласно изобретению.

Подробное описание изобретения

Нижеследующие примеры используются для иллюстрации настоящего изобретения, но не ограничивают объема настоящего изобретения. В способы, стадии или условия изобретения могут быть внесены любые исправления и замены, не выходящие за рамки существа и объема изобретения, и эти исправления и замены также входят в объем настоящего изобретения.

Если это не оговорено особо, то все химические реагенты, используемые в примерах, являются обычными коммерчески доступными реагентами, а методы, используемые в примерах, являются стандартными методами, известными специалистам в данной области.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды для сверхэкспрессии генов ацетил-CoA-карбоксилазы accBC и accDA.

Ген accBC (нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NО:1) размером приблизительно 1,8 т.п.о. получали путем ПЦР-амплификации с использованием генома Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 в качестве матрицы и праймеров accBC-F (tagcgcagtaaAAGGAGATATACCatgtcagtcgagactaggaaga) и accBC-R (CTGCAGGCGCGCCGAGCTCGttacttgatctcgaggagaacaacgсс) и очищали.

Ген accDA (нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NО:2) размером приблизительно 1,5 т.п.о. получали путем ПЦР-амплификации с использованием генома Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 в качестве матрицы и праймеров accDA-F (GTTTAACTTTAATAAGGAGATATACatggtgtggggcatggaac) и accDA-R (TATATCTCCTTttactgcgctaaacgctcaaatcg) и очищали. Плазмиду pACYCDuet (Novagen) расщепляли ферментами NcoI и EcoRI, а очищенные фрагменты accBC и accDA подвергали одностадийному лигированию с pACYCDuet с использованием набора для сборки Гибсона (NEB) с получением рекомбинантной плазмиды, обозначенной pACYC-accDABC.

Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмиды для сверхэкспрессии гена малонил-СоА-синтетазы mcr.

Исходя из аминокислотной последовательности малонил-СоА-синтетазы, происходящей от Chloroflexus aurantiacus, оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты гена искусственно конструировали (последовательность гена представлена в SEQ ID NO.3) и синтезировали в Qinglan Biotech. Inc. Фрагмент mcr размером приблизительно 3,7 т.п.о. получали с помощью ПЦР с использованием генного фрагмента в качестве матрицы и с использованием праймеров mcr-F (GCGATCGCTGACGTCGGTACAAGGAGATATACATATGTCGGGCACTG) и mcr-R (TTTACCAGACTCGAGGGTACTTAAACGGTGATTGCGCGTCC) и очищали. Плазмиду pACYC-accDABC, полученную как описано в примере 1, расщепляли ферментом KpnI, и фрагмент mcr подвергали одностадийному лигированию с pACYC-accDABC с использованием набора для сборки Гибсона (NEB) с получением рекомбинантной плазмиды pACYC-accDABC-mcr. После переноса PACYC-accDABC-mcr в E.coli BL21 (DE3) методом тепловой трансформации, рекомбинантный микроорганизм отбирали в планшете со средой LB, содержащей 25 мг/л хлорамфеникола, и этот микроорганизм был обозначен E.coli/pACYC-accDABC-mcr.

Пример 3. Конструирование рекомбинантной плазмиды для сверхэкспрессии гена 3-гидроксипропионил-СоА-синтетазы pcs, гена 3-гидроксипропионил-CoA-редуктазы pduP и гена 1,3-пропандиолоксидоредуктазы yqhD.

Исходя из аминокислотной последовательности 3-гидроксипропионил-СоА-синтетазы Metallosphaera sedula, оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты гена искусственно конструировали (последовательность гена представлена в SEQ ID NO: 4) и синтезировали в Qinglan Biotech. Inc. Фрагмент pcs размером приблизительно 2,0 т.п.о. получали с помощью ПЦР с использованием генного фрагмента в качестве матрицы и с использованием праймеров pcs-F (CTTTAAGAAGGAGATATACCaggaggaaacagaaccATGTTTATGCGC) и pcs-R (acgttaatggTTAGGAAGTCTTTAATTCCTTCTTCAGTTCTTCCAC) и очищали. Ген pduP размером приблизительно 1,5 т.п.о. (нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NО: 5) получали с помощью ПЦР с использованием генома Klebsiella pneumoniae DSM2026 в качестве матрицы, и с использованием праймеров pduP-F (GACTTCCTAAccattaacgtgagaactcatcaatgaatacag) и pduP-R (atATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTttagcgaatggaaaaaaccgttggt), а затем очищали. Ген yqhD-F размером приблизительно 1,2 т.п.о. (нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NО: 6) получали с помощью ПЦР с использованием генома E.coli W3110 в качестве матрицы, и праймеров yqhD-F (TAAGAAGGAGATATACATatgAACAACTTTAATCTGCACACC) и yqhD-R (CAAGCTTGTCGACGGAGCTCGCGGGCGGCTTCGTATATACG) и очищали. Плазмиду pET32a (Novagen) расщепяли ферментами NcoI и EcoRI, и фрагмент pcs, фрагмент pduP и фрагмент yqhD подвергали одностадийному лигированию с pET28a с получением рекомбинантной плазмиды, обозначенной pET-pcs-pduP-yqhD. После переноса pET-pcs-pduP-yqhD в E.coli/pACYC-accDABC-mcr, полученную как описано в Примере 2, методом тепловой трансформации, рекомбинантный микроорганизм отбирали в планшете со средой LB, содержащей 25 мг/л канамицина и 25 мг/л хлорамфеникола, и этот микроорганизм был обозначен E.coli/pACYC-accDABC-mcr/pET-pcs-pduP-yqhD.

Пример 4: Получение 1,3-пропандиола путем ферментации с помощью рекомбинантной E.coli

После культивирования штамма E.coli/pACYC-accDABC-mcr/pET-pcs-pduP-yqhD, полученного как описано в Примере 3, в планшете со средой LB, содержащей канамицин (25 мг/л) и хлорамфеникол (25 мг/л) в течение ночи, одну колонию, взятую из свежего планшета, инокулировали в 250 мл-колбу с перегородкой, содержащую 30 мл среды для посевной культуры, и инкубировали в течение 16 часов при 30°C и 200 об/мин.

Состав среды посевной культуры включает (г/л): глюкозу, 20; дрожжевой экстракт, 5,0; пептон, 10; NaCl, 5,0; хлорамфеникол, 0,025; и канамицин, 0,025.

Посевной бульон инокулировали в 1000 мл-колбу с перегородкой, содержащую 100 мл среды для сбраживания культуры в инокулируемом количестве 10% и инкубировали при 30°C и 200 об/мин. Через 6 часов после ферментации добавляли IPTG (0,5 мМ) и ферментацию продолжали еще 48 часов.

Состав среды для сбраживания культуры включает (г/л): глюкозу, 20; Na₂HPO₄ · 7H₂O, 12,8; K₂HPO₄, 3,0; MgSO₄, 0,5,; NaCl 0,5; NH₄Cl, 0,5; дрожжевой экстракт, 10; биотин, 0,001; гидрохлорид тиамина, 0,001; хлорамфеникол, 0,025 и канамицин, 0,025.

Штамм E.coli/pACYC-accDABC-mcr/pET-pcs-pduP-yqhD, полученный как описано в Примере 3, тестировали через 24 часа после ферментации на Ферментативные активности ацетил-CoA-карбоксилазы, малонил-CoA-синтетазы, 3-гидроксипропионил-CoA- синтетазы, 3-гидроксипропионил-CoA-редуктазы и 1,3-пропандиолоксидоредуктазы, которые составляли 0,24 Ед/мг, 0,12 Ед/мг, 0,38 Ед/мг, 0,97 Ед/мг и 1,72 Ед/мг, соответственно, что указывает на то, что каждый рекомбинантный фермент экспрессировался нормально. В контрольном штамме E. coli BL21 (DE3) дикого типа каких-либо значимых соответствующих ферментативных активностей не обнаруживалось.

Через 48 часов после ферментации, штамм E.coli/pACYC-accDABC-mcr/pET-pcs-pduP-yqhD, полученный как описано в Примере 3, мог продуцировать 2,1 г/л 1,3-пропандиола со скоростью превращения массы 0,105 г/г глюкозы, что указывает на то, что сконструированный рекомбинантный штамм может превратить глюкозу непосредственно в 1,3-пропандиол без добавления кофермента B12. В контрольном эксперименте, проведенном в тех же условиях, ни штамм E.coli BL21 (DE3) дикого типа, ни штамм E.coli/pACYC-accDABC-mcr, полученный как описано в Примере 2, не могли продуцировать 1,3-пропандиол.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано в общем описании и в его вышеуказанных вариантах, однако, специалистам в данной области очевидно, что в него могут быть внесены модификации или изменения исходя из раскрытия настоящего изобретения. Таким образом, эти модификации или изменения, не выходящие за рамки существа изобретения, входят в объем настоящего изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> TSINGHUA UNIVERSITY

<120> СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1,3-ПРОПАНДИОЛА ПУТЕМ ФЕРМЕНТАЦИИ

РЕКОМБИНАНТНОГО МИКРООРГАНИЗМА

<130> P2018TC532

<150> CN 201711405440.5

<151> 2017-12-22

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1776

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ген accBC

<400> 1

atgtcagtcg agactaggaa gatcaccaag gttcttgtcg ctaaccgtgg tgagattgca 60

atccgcgtgt tccgtgcagc tcgagatgaa ggcatcggat ctgtcgccgt ctacgcagag 120

ccagatgcag atgcaccatt cgtgtcatat gcagacgagg cttttgccct cggtggccaa 180

acatccgctg agtcctacct tgtcattgac aagatcatcg atgcggcccg caagtccggc 240

gccgacgcca tccaccccgg ctacggcttc ctcgcagaaa acgctgactt cgcagaagca 300

gtcatcaacg aaggcctgat ctggattgga ccttcacctg agtccatccg ctccctcggc 360

gacaaggtca ccgctcgcca catcgcagat accgccaagg ctccaatggc tcctggcacc 420

aaggaaccag taaaagacgc agcagaagtt gtggctttcg ctgaagaatt cggtctccca 480

atcgccatca aggcagcttt cggtggcggc ggacgtggca tgaaggttgc ctacaagatg 540

gaagaagtcg ctgacctctt cgagtccgca acccgtgaag caaccgcagc gttcggccgc 600

ggcgagtgct tcgtggagcg ctacctggac aaggcacgcc acgttgaggc tcaggtcatc 660

gccgataagc acggcaacgt tgttgtcgcc ggaacccgtg actgctccct gcagcgccgt 720

ttccagaagc tcgtcgaaga agcaccagca ccattcctca ccgatgacca gcgcgagcgt 780

ctccactcct ccgcgaaggc tatctgtaag gaagctggct actacggtgc aggcaccgtt 840

gagtacctcg ttggctccga cggcctgatc tccttcctcg aggtcaacac ccgcctccag 900

gtggaacacc cagtcaccga agagaccacc ggcatcgacc tggtccgcga aatgttccgc 960

atcgcagaag gccacgagct ctccatcaag gaagatccag ctccacgcgg ccacgcattc 1020

gagttccgca tcaacggcga agacgctggc tccaacttca tgcctgcacc aggcaagatc 1080

accagctacc gcgagccaca gggcccaggc gtccgcatgg actccggtgt cgttgaaggt 1140

tccgaaatct ccggacagtt cgactccatg ctggcaaagc tgatcgtttg gggcgacacc 1200

cgcgagcagg ctctccagcg ctcccgccgt gcacttgcag agtacgttgt cgagggcatg 1260

ccaaccgtta tcccattcca ccagcacatc gtggaaaacc cagcattcgt gggcaacgac 1320

gaaggcttcg agatctacac caagtggatc gaagaggttt gggataaccc aatcgcacct 1380

tacgttgacg cttccgagct cgacgaagat gaggacaaga ccccagcaca gaaggttgtt 1440

gtggagatca acggccgtcg cgttgaggtt gcactcccag gcgatctggc actcggtggc 1500

accgctggtc ctaagaagaa ggccaagaag cgtcgcgcag gtggtgcaaa ggctggcgta 1560

tccggcgatg cagtggcagc tccaatgcag ggcactgtca tcaaggtcaa cgtcgaagaa 1620

ggcgctgaag tcaacgaagg cgacaccgtt gttgtcctcg aggctatgaa gatggaaaac 1680

cctgtgaagg ctcataagtc cggaaccgta accggcctta ctgtcgctgc aggcgagggt 1740

gtcaacaagg gcgttgttct cctcgagatc aagtaa 1776

<210> 2

<211> 1455

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ген accDA

<400> 2

atggtgtggg gcatggaaca cacttcagca ttgacgctca tagactcggt tttggaccct 60

gacagcttca tttcttggaa tgaaactccc caatatgaca acctcaatca aggctatgca 120

gagaccttgg agcgggctcg aagcaaggcc aaatgcgatg aatcggtaat tactggagaa 180

ggcaccgtgg agggcattcc ggtagccgtt attttgtccg atttttcctt cctcggcggt 240

tctttgggca cggtcgcgtc ggtgcgcatc atgaaggcga ttcaccgcgc cacagagctg 300

aaactcccac tgctggtctc ccctgcttcc ggtggtgcgc gcatgcagga agacaatcga 360

gcttttgtca tgatggtgtc cataaccgcg gctgtgcagc gtcaccgcga ggcgcatttg 420

ccgttcctgg tgtatttgcg caatcccacg atgggtggcg ccatggcctc gtggggttca 480

tctgggcatc tcacttttgc ggaacccggc gcgcagatag gtttcctggg tcctcgcgtg 540

gtggagttaa ccactgggca tgcgcttcca gacggtgtgc agcaggcgga gaatttggtg 600

aaaactggtg tgattgatgg aattgtgtcg ccactccaat tgcgtgcagc ggtggcaaaa 660

accctcaagg ttattcagcc ggtagaggca acggatcgtt tttctccaac aactcctggc 720

gtggcacttc cggtgatgga ggcgattgcg cgttctcgtg acccgcagag gcctggaatc 780

ggggagatta tggaaacgtt gggggcagac gtcgtcaagc tttctggtgc gcgtgctggc 840

gcattgagcc cggctgtgcg cgttgccctg gcgcgcatcg ggggccggcc cgtggtgctg 900

attgggcagg atcgccgctt cacgcttggg ccgcaggagc tgcgttttgc gcgtcgtggc 960

atttcgctgg cgcgcgagct aaacctgccg atcgtgtcca tcatcgacac ctccggcgcc 1020

gaattgtcgc aggcggctga ggagctcggc atcgcaagct cgattgcgcg caccttgtcc 1080

aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt tcggtcatta ttggtcaggg cgttggcggt 1140

ggcgcgctgg ccatgctgcc cgccgatctg gtctacgcgg ccgaaaacgc gtggctgtcc 1200

gcattgccac cagagggcgc ctcggccatc ctcttccgcg acaccaacca cgccgcggaa 1260

atcatagagc gacaaggcgt gcaggcgcac gcacttttaa gccaagggct tatcgacggg 1320

atcgtcgccg aaaccgagca ctttgttgaa gaaattctcg gcacaatcag caacgccctc 1380

tccgaattgg ataacaatcc ggagagggcg ggacgcgaca gtcgcttcac acgatttgag 1440

cgtttagcgc agtaa 1455

<210> 3

<211> 3663

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ген mcr

<400> 3

atgtcgggca ctgggcgttt agccggtaaa atcgcgttga tcacgggcgg agcgggtaac 60

attggttctg aattgacgcg tcgctttttg gcggagggcg cgacggtcat catttctgga 120

cgcaaccgcg ccaaactgac ggcgttggct gagcgcatgc aagccgaagc aggagtgcct 180

gctaaacgca tcgatctgga agtcatggac ggttcggatc ccgtggcagt acgcgcgggt 240

atcgaagcaa ttgtagcacg ccacggacag attgatattt tagtcaacaa cgctggttcg 300

gcgggggcgc agcgccgtct ggcagaaatc ccattaactg aggcagagtt agggcccggt 360

gcagaagaga ccttacatgc gtccattgct aacctgcttg ggatgggctg gcacttgatg 420

cgcatcgcgg ctccacacat gcctgtaggc tctgccgtga ttaatgtaag cacaatcttt 480

tcacgcgccg agtactatgg tcgtatccct tatgtaacgc caaaggcagc ccttaatgca 540

cttagtcagc ttgcggcgcg cgagttaggt gctcgtggca tccgtgtgaa tacgattttt 600

ccagggccaa ttgagtccga tcgcattcgt acggtgtttc agcgcatgga tcagttgaag 660

ggccgcccgg aaggagacac agcacaccac tttctgaata ctatgcgcct ttgtcgtgcg 720

aacgaccaag gagctttgga acgccgtttc ccgagcgtcg gagacgtggc agatgctgcc 780

gtgtttttgg ccagtgccga gagtgctgcg ctttcgggag agactatcga ggtcactcac 840

ggtatggaac ttccagcgtg ctccgagaca tcacttctgg cacgtactga cttgcgtact 900

attgacgcgt caggccgtac taccctgatt tgcgcgggag atcaaattga agaggtcatg 960

gcgttgaccg gcatgctgcg cacatgtggg agtgaagtaa tcatcggatt ccgttccgca 1020

gcagcgttgg cgcagtttga acaggctgtt aacgaatccc gccgtttggc aggggctgac 1080

ttcactcctc ctatcgccct gccattagat ccacgtgatc cggctacaat cgatgcagtg 1140

ttcgattggg gtgcaggaga aaacacgggc gggatccacg ctgctgtaat cttaccggcg 1200

accagtcacg agcccgctcc ctgtgtcatc gaggtcgatg acgagcgtgt ccttaatttt 1260

ctggctgatg aaattacagg gaccattgta atcgcatctc gccttgcccg ttattggcaa 1320

agtcagcgtt tgacgcctgg tgcgcgtgcg cgcgggccac gtgtaatttt tctgtcgaat 1380

ggcgctgacc aaaatggcaa tgtgtacgga cgcattcaga gcgcagcaat tgggcaactt 1440

atccgtgtgt ggcgtcatga ggctgaattg gattatcagc gtgcaagtgc tgcgggggat 1500

cacgttttac ctcccgtgtg ggcaaaccag attgttcgct ttgccaaccg tagtctggag 1560

ggtctggagt ttgcctgtgc ttggacggcg caacttctgc actcacagcg ccacattaac 1620

gagattactc tgaacatccc tgctaacatt tccgcgacca ccggcgcccg ttcggcttcg 1680

gtggggtggg cggaatcatt aatcgggctg catcttggta aggtggcgtt aattactgga 1740

ggtagcgccg gcattggagg gcaaattggg cgcctgcttg ctttatctgg ggcccgtgtg 1800

atgttggcgg cgcgcgaccg tcataagctg gaacagatgc aggctatgat tcagagcgag 1860

ttagccgaag tagggtatac cgacgttgaa gatcgcgtcc acattgcacc gggttgcgat 1920

gtatcaagcg aagctcaatt agccgattta gttgagcgca ccttgtccgc atttggtacc 1980

gtcgattatt taatcaataa tgcgggcatt gcgggcgtag aggagatggt tatcgacatg 2040

ccagtcgaag gctggcgcca cacgcttttt gcgaatctga tcagtaatta tagtttgatg 2100

cgcaaattag ctccgttaat gaagaagcaa ggatccggct acatcctgaa tgtatcatct 2160

tatttcggcg gagaaaaaga tgcggcgatt ccatacccga accgtgcgga ttacgctgta 2220

tcgaaggctg gtcaacgcgc tatggccgag gtatttgccc gtttcttagg tccagagatt 2280

cagatcaatg ccattgcacc aggccccgtt gagggcgatc gcttacgcgg gactggggag 2340

cgcccagggt tgtttgcgcg ccgcgcccgc cttatccttg agaataaacg cttaaacgaa 2400

ttgcacgcag ctcttatcgc cgctgcccgc actgacgagc gtagcatgca cgagttagtg 2460

gaactgttgt taccaaacga tgttgctgcg ctggagcaga atcctgccgc tcccactgcc 2520

ttgcgtgaat tagcacgccg ttttcgtagc gaaggtgacc ctgctgcctc gtcgtcatcc 2580

gcccttctta accgctccat tgctgccaag ttgctggccc gtttacacaa cggcgggtat 2640

gtgctgcccg ctgacatctt cgcgaatctg ccgaatccac ccgatccctt cttcacccgt 2700

gctcaaatcg accgcgaagc gcgcaaagtt cgcgatggta tcatgggcat gctgtacttg 2760

cagcgcatgc cgactgaatt tgatgtagcc atggcgaccg tgtactattt ggctgatcgc 2820

aacgtcagcg gagagacctt tcacccgtcc gggggattac gttatgagcg tactcctacg 2880

gggggagaat tgtttggcct gccttcacca gagcgccttg ccgaacttgt gggttcgact 2940

gtatacttaa tcggagaaca cttaactgaa catctgaatc tgctggcacg cgcatatctt 3000

gagcgttatg gagcgcgtca agtggtcatg attgtcgaaa ctgagaccgg tgccgagacg 3060

atgcgtcgtt tattacacga ccacgtggaa gccggacgct taatgacaat cgtagctggg 3120

gatcaaatcg aagcagcaat cgaccaagcg attacccgtt acggtcgccc ggggccggtc 3180

gtgtgcaccc cttttcgtcc tcttcccact gtccctttag tagggcgtaa ggacagtgac 3240

tggagtaccg tgctttcaga agccgagttt gctgagttgt gcgagcatca attaacacat 3300

catttccgcg tagcccgtaa gatcgcgtta tcagatggtg catctttggc tcttgttact 3360

ccagaaacaa ctgctacctc tacgaccgag cagtttgctt tggccaactt tattaagaca 3420

acattacatg ccttcacggc caccatcggc gttgagagcg aacgcaccgc tcagcgtatt 3480

ctgattaatc aggtggactt gactcgccgt gcgcgtgcgg aagagccgcg tgatccacat 3540

gagcgtcaac aagaattgga acgttttatt gaagcggttt tacttgttac agctcctctt 3600

cccccagagg ctgatactcg ctacgcgggt cgcattcacc gcggacgcgc aatcaccgtt 3660

taa 3663

<210> 4

<211> 1986

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ген pcs

<400> 4

atgtttatgc gctacatcat ggtggaagag cagactttga aaactggaag ccaagagctt 60

gaagaaaaag ctgattataa tatgcgttac tacgcacacc ttatgaagct gtctaaagaa 120

aagcctgccg aattttgggg ctctttggcg caagatcttc tggattggta tgagccctgg 180

aaggaaacga tgcgccaaga ggaccccatg acgcgctggt tcattggcgg gaagattaat 240

gcgtcctaca atgctgtgga ccgtcatttg aacggccccc gcaaattcaa agctgcggta 300

atctgggaga gtgagttggg ggaacgtaaa atcgttactt accaagacat gttctacgaa 360

gtcaaccgct gggcaaacgc cttacgcagt cttggcgtag gtaaaggaga tcgcgtgacc 420

atttatatgc cgctgacccc agaaggaatc gcggccatgc tggcgtcagc tcgtattgga 480

gcgattcatt cagttatctt cgccggattt ggatcgcaag ccatcgccga ccgcgttgag 540

gacgccaagg caaaagtcgt aatcaccgct gacgcatatc ctcgtcgtgg taaagtagtt 600

gaactgaaaa agacagtgga cgaggccctt aattctttag gtgaacgtag tccagtgcaa 660

cacgtcctgg tctatcgccg catgaagaca gacgttaaca tgaaagaagg gcgcgacgtt 720

ttcttcgacg aagtgggcaa ataccgctat gtggagcctg aacgtatgga ttctaacgac 780

cccttattta ttctgtacac gtcaggtact acaggtaaac caaaggggat tatgcactcg 840

actggaggat atttgaccgg gacggcggtt atgctgcttt ggtcatatgg actgtcgcag 900

gagaatgatg tattattcaa tacttcagac atcggctgga tcgtgggtca ctcttacatc 960

acttactcgc cgttaatcat gggtcgcacg gtggtgatct atgagtctgc ccccgattac 1020

ccatatcccg ataagtgggc ggagatcatt gagcgttatc gcgctacaac ttttggtact 1080

tcagccacgg cgttgcgcta tttcatgaaa tacggggacg aatatgttaa gaatcatgat 1140

ttaagttcta ttcgtattat cgttacgaat ggcgaagttt tgaactatag cccctggaaa 1200

tggggcttgg aagtgcttgg tggcggcaag gtattcatgt cgcatcaatg gtggcaaacg 1260

gagaccggag cacctaattt aggctacctg cctggcatta tttatatgcc gatgaaatct 1320

gggccagcgt ctggctttcc tctgcctgga aatttcgttg aagtccttga cgagaatggt 1380

aacccgagtg cgcctcgtgt acgtggctac cttgtaatgc gtccaccctt ccccccaaac 1440

atgatgatgg gcatgtggaa tgacaacgga gagcgcctga agaaaactta tttctcaaaa 1500

tttggaagct tatactaccc cggagacttc gctatggttg atgaagacgg ttatatctgg 1560

gtactgggtc gtgcggacga gacgttaaag atcgcggcac atcgtatcgg tgccggcgag 1620

gtcgaaagcg caatcacctc tcacccatca gttgcagaag ccgcagttat tggagttccg 1680

gattcagtga agggcgagga ggtgcatgcc ttcgtggttc tgaaacaagg gtacgctccg 1740

tcctctgagc ttgcaaagga cattcaaagt catgtccgta aagtcatggg ccctattgta 1800

tcgccacaga ttcactttgt tgataaactt cctaagactc gctcgggtaa ggtgatgcgc 1860

cgtgtcatta aggccgtgat gatgggatcg tcggcaggcg accttaccac gattgaagac 1920

gaagcaagca tggatgaaat caagaaggcg gtggaagaac tgaagaagga attaaagact 1980

tcctaa 1986

<210> 5

<211> 1389

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ген pduP

<400> 5

atgaatacag cagaactgga aacccttatc cgcaccatcc tcagtgaaaa gctcgcgccg 60

acgccccctg cccctcagca agagcagggc attttctgcg atgtcggcag cgccatcgac 120

gccgctcatc aggcttttct ccgctatcag cagtgtccgc taaaaacccg cagcgccatt 180

atcagcgccc tgcgggagac gctggccccc gagctggcga cgctggcgga agagagcgcc 240

acggaaaccg gcatgggcaa caaagaagat aaatatctga aaaataaagc cgctcttgaa 300

aacacgccgg gcatagagga tctcactacc agcgccctca ccggcgatgg cgggatggtg 360

ctgtttgagt actcgccgtt cggggttatt ggcgccgtgg cgcccagcac caacccaacg 420

gaaaccatta tcaacaacag tatcagcatg ctggcggcgg gtaacagcgt ctatttcagc 480

ccccatcccg gcgcgaaaaa ggtctcgttg aagcttatcg ccaggatcga agagatcgcc 540

taccgctgca gcgggatccg taacctggtg gtgaccgttg ccgagccgac ctttgaagcc 600

acccagcaaa tgatgtccca cccgctgatt gccgttctgg ctatcaccgg cggccctggc 660

attgtggcga tgggcatgaa aagcggtaaa aaagtgatcg gcgctggcgc cggcaatccg 720

ccgtgcatcg ttgatgaaac cgccgatctc gtcaaagccg ccgaagatat catcagcggc 780

gccgccttcg attacaacct gccctgtatc gccgaaaaaa gcctgatcgt cgtcgcctcc 840

gtcgctgacc gcctgatcca gcagatgcag gattttgacg cgctgctgtt gagccgacag 900

gaggccgata ccctgcgtgc cgtctgcctg cccgacggcg cggcgaataa aaaactggtc 960

ggtaaaagcc cggctgcgct gctggcggcg gcgggtctcg ccgttccgcc tcgcccccct 1020

cgcctgctga tagccgaggt ggaggcgaac gacccctggg tgacctgcga gcagctgatg 1080

ccggtgctgc cgatcgtcag ggtcgccgac tttgacagcg ccctggcgct ggccctgcgc 1140

gttgaggagg gtctgcacca caccgccatt atgcactcgc agaatgtctc gcggctcaat 1200

ctggcggcac gcacgctgca gacctccatt tttgtcaaaa atggcccgtc ttacgcggga 1260

atcggcgtcg gcggcgaagg gtttaccacc ttcaccatcg ccacgccaac cggagaaggc 1320

accacctccg cgcggacgtt cgcccgcctg cggcgctgcg tgttgaccaa cggtttttcc 1380

attcgctaa 1389

<210> 6

<211> 1164

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ген yqhD

<400> 6

atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60

ggtttacgcg aacaaattcc tcacgatgct cgcgtattga ttacctacgg cggcggcagc 120

gtgaaaaaaa ccggcgttct cgatcaagtt ctggatgccc tgaaaggcat ggacgtgctg 180

gaatttggcg gtattgagcc aaacccggct tatgaaacgc tgatgaacgc cgtgaaactg 240

gttcgcgaac agaaagtgac tttcctgctg gcggttggcg gcggttctgt actggacggc 300

accaaattta tcgccgcagc ggctaactat ccggaaaata tcgatccgtg gcacattctg 360

caaacgggcg gtaaagagat taaaagcgcc atcccgatgg gctgtgtgct gacgctgcca 420

gcaaccggtt cagaatccaa cgcaggcgcg gtgatctccc gtaaaaccac aggcgacaag 480

caggcgttcc attctgccca tgttcagccg gtatttgccg tgctcgatcc ggtttatacc 540

tacaccctgc cgccgcgtca ggtggctaac ggcgtagtgg acgcctttgt acacaccgtg 600

gaacagtatg ttaccaaacc ggttgatgcc aaaattcagg accgtttcgc agaaggcatt 660

ttgctgacgc taatcgaaga tggtccgaaa gccctgaaag agccagaaaa ctacgatgtg 720

cgcgccaacg tcatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtttgattgg cgctggcgta 780

ccgcaggact gggcaacgca tatgctgggc cacgaactga ctgcgatgca cggtctggat 840

cacgcgcaaa cactggctat cgtcctgcct gcactgtgga atgaaaaacg cgataccaag 900

cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttccgatgat 960

gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg 1020

acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg 1080

gaagagcacg gcatgaccca actgggcgaa aatcatgaca ttacgttgga tgtcagccgc 1140

cgtatatacg aagccgcccg ctaa 1164

<210> 7

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер accBC-F

<400> 7

tagcgcagta aaaggagata taccatgtca gtcgagacta ggaaga 46

<210> 8

<211> 47

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер accBC-R

<400> 8

ctgcaggcgc gccgagctcg ttacttgatc tcgaggagaa caacgcc 47

<210> 9

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер accDA-F

<400> 9

gtttaacttt aataaggaga tatacatggt gtggggcatg gaac 44

<210> 10

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер accDA-R

<400> 10

tatatctcct tttactgcgc taaacgctca aatcg 35

<210> 11

<211> 47

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер mcr-F

<400> 11

gcgatcgctg acgtcggtac aaggagatat acatatgtcg ggcactg 47

<210> 12

<211> 41

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер mcr-R

<400> 12

tttaccagac tcgagggtac ttaaacggtg attgcgcgtc c 41

<210> 13

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер pcs-F

<400> 13

ctttaagaag gagatatacc aggaggaaac agaaccatgt ttatgcgc 48

<210> 14

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер pcs-R

<400> 14

acgttaatgg ttaggaagtc tttaattcct tcttcagttc ttccac 46

<210> 15

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер pduP-F

<400> 15

gacttcctaa ccattaacgt gagaactcat caatgaatac ag 42

<210> 16

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер pduP-R

<400> 16

atatgtatat ctccttctta aagttttagc gaatggaaaa accgttggt 49

<210> 17

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер yqhD-F

<400> 17

taagaaggag atatacatat gaacaacttt aatctgcaca cc 42

<210> 18

<211> 41

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер yqhD-R

<400> 18

caagcttgtc gacggagctc gcgggcggct tcgtatatac g 41

<---

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения 1,3-пропандиола посредством ферментации рекомбинантного микроорганизма, который может сверхэкспрессировать гены ацетил-СоА-карбоксилазы accBC и accDA; ген малонил-СоА-синтетазы mcr; ген 3-гидроксипропионил-СоА-синтетазы pcs, ген 3-гидроксипропионил-СоА-редуктазы pduP и ген 1,3-пропандиолоксидоредуктазы yqhD. Рекомбинантный микроорганизм подвергают ферментации в сбраживаемой культуре в колбе или в ферментере с использованием глюкозы в качестве сырья с получением 1,3-пропандиола. Рекомбинантный микроорганизм может утилизовать глюкозу, сахарозу, мелассу, ксилозу и т.п. в качестве сырья в процессе ферментации без добавления дорогостоящего витамина B12. Изобретение позволяет получать 1,3-пропандиол с высокой степенью эффективности. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 пр.

Формула