Цельноклеточная система для биокатализа монооксигеназ цитохрома p450 - RU2015153538A
Код документа: RU2015153538A
Формула
1. Генетически конструируемый микроорганизм, способный преобразовывать холестерин, аналоги и производные холестерина в предшественники стероидных гормонов, где указанный микроорганизм содержит по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую цитохром P450 эукариотического происхождения, экзогенную последовательность ДНК, кодирующую Adx, и экзогенную последовательность ДНК, кодирующую AdR.
2. Генетически конструируемый микроорганизм по п. 1, где указанный цитохром P450 эукариотического происхождения выбран из группы, состоящей из CYP11A1, CYP17A1, CYP11B1, CYP11B2, CYP3A4, CYP46A1, CYP27A1, CYP21A1 и CYP21A2.
3. Генетически конструируемый микроорганизм по п. 1, где указанные экзогенные последовательности ДНК вводили в указанный микроорганизм способами генетической инженерии.
4. Генетически конструируемый микроорганизм по п. 3, где указанный микроорганизм трансформировали по меньшей мере одной плазмидой, содержащей указанные экзогенные последовательности ДНК.
5. Генетически конструируемый микроорганизм по п. 1, где указанные экзогенные последовательности ДНК интегрируют в геном указанного микроорганизма.
6. Генетически конструируемый микроорганизм по п. 1, где указанные микроорганизм дополнительно содержит функциональную систему эндогенных полимераз, способную образовывать полигидроксиалканоатные тельца.
7. Генетически конструируемый микроорганизм по п. 1, где указанный микроорганизм представляет собой Bacillus megaterium.
8. Генетически конструируемый микроорганизм по п. 7, где указанный микроорганизм представляет собой штамм MS941 Bacillus megaterium.
9. Генетически конструируемый микроорганизм по п. 1, где модулируют экспрессию по меньшей мере одного гена, участвующего в образовании полигидроксиалканоатных тельц.
10. Способ получения предшественников стероидных гормонов, включающий этапы:
a. предоставления микроорганизма по любому из пп. 1-9,
b. культивирования указанного микроорганизм в условиях, обеспечивающих экспрессию указанных экзогенных последовательностей ДНК,
c. приведения культуры указанного микроорганизма в контакт с субстратом, выбранным из группы, состоящей из холестерина, аналогов и производных холестерина, и
d. выделения предшественников стероидных гормонов.
11. Способ по п. 10, где
a. указанный субстрат выбран из группы, состоящей из холестерина, кампестерина, эргостадиенола, десмостерина, бета-ситостерина, генерола и смеси оксистеролов, и
b. предшественник указанных стероидных гормонов представляет собой прегненолон.
12. Способ по п. 10, где указанный субстраты солюбилизируют в β-циклодекстрине и сапонине.
13. Способ получения рекомбинантных штаммов, которые являются улучшенными в отношении преобразования холестерина, аналогов и производных холестерина в предшественники стероидных гормонов, включающий этапы:
a. предоставления микроорганизма,
b. введения способами генетической инженерии в указанный микроорганизм по меньшей мере одной последовательности ДНК, кодирующей цитохром P450 эукариотического происхождения, экзогенной последовательности ДНК, кодирующей Adx, и экзогенной последовательности ДНК, кодирующей AdR.
14. Способ по п. 13, где указанный цитохром P450 эукариотического происхождения выбран из группы, состоящей из CYP11A1, CYP17A1, CYP11B1, CYP11B2, CYP3A4, CYP46A1, CYP27A1, CYP21A1 и CYP21A2.
15. Способ по п. 13, где указанный микроорганизм содержит функциональную систему эндогенных полимераз, способную образовывать полигидроксиалканоатные тельца.
16. Способ по любому из пп. 13-15, где указанный микроорганизм представляет собой Bacillus megaterium.
17. Способ по п. 16, где указанный микроорганизм представляет собой штамм MS941 Bacillus megaterium.
18. Способ по п. 13, дополнительно включающий этап модулирования способами генетической инженерии экспрессии по меньшей мере одного гена, участвующего в образовании PHA-телец, в указанном микроорганизме.
19. Способ увеличения накопительной способности микроорганизма в отношении (i) холестерина, аналогов холестерина и его производных и/или (ii) предшественников стероидных гормонов и их производных, включающий этапы:
a. предоставления микроорганизма, содержащего функциональную систему эндогенных полимераз, способную образовывать полигидроксиалканоатные тельца; и
b. модуляцию способами генетической инженерии экспрессии по меньшей мере одного гена, участвующего в образовании PHA-телец, в указанном микроорганизме,
таким образом, получая микроорганизм с повышенной накопительной способностью в отношении (i) холестерина, аналогов холестерина и его производных и/или (ii) предшественников стероидных гормонов и их производных.
20. Способ по п. 19, где указанная накопительная способность является пропорционально повышенной относительно экспрессии гена полимеразы PhaC.
21. Способ по п. 19 или 20, где указанный микроорганизм представляет собой Bacillus megaterium.
22. Способ по п. 21, где указанный микроорганизм представляет собой штамм MS941 Bacillus megaterium.
