Стабильные клеточные линии для продуцирования ретровирусов - RU2018122636A
Код документа: RU2018122636A
Формула
1. Ретровирусная продуцирующая клетка, содержащая последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие
gag и pol белки;
env белок; и
РНК геном ретровирусной векторной частицы,
где указанные последовательности нуклеиновых кислот все расположены в едином локусе внутри генома ретровирусной продуцирующей клетки в виде индивидуальных экспрессирующих конструкций.
2. Ретровирусная продуцирующая клетка по п. 1, которая дополнительно содержит вспомогательный ген rev или аналогичный ему ген или функционально аналогичную систему.
3. Ретровирусная продуцирующая клетка по п. 1 или 2, где ретровирусные последовательности нуклеиновых кислот получают из ретровируса, выбранного из лентивируса, альфа-ретровируса, гамма-ретровируса или пенящего ретровируса.
4. Ретровирусная продуцирующая клетка по п. 3, где ретровирусные последовательности нуклеиновых кислот получают из лентивируса, выбранного из группы, состоящей из HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, EIAV и висна.
5. Ретровирусная продуцирующая клетка по п. 4, где ретровирусные последовательности нуклеиновых кислот получают из HIV-1.
6. Ретровирусная продуцирующая клетка по любому из пп. 1-5, где env белок или его функциональный заменитель получают из вируса везикулярного стоматита.
7. Ретровирусная продуцирующая клетка по любому из пп. 1-6, которая дополнительно содержит элемент регуляции транскрипции.
8. Ретровирусная продуцирующая клетка по п. 7, где элементом регуляции транскрипции является CMV промотор.
9. Ретровирусная продуцирующая клетка по п. 8, где CMV промотор дополнительно содержит, по меньшей мере, один Tet оперон.
10. Ретровирусная продуцирующая клетка по любому из пп. 1-9, которая дополнительно содержит репрессорный белок оперона устойчивости к тетрациклину (TetR).
11. Ретровирусная продуцирующая клетка по любому из пп. от 1 до 10, которая дополнительно содержит инсулятор.
12. Ретровирусная продуцирующая клетка по п. 11, где инсулятор присутствует между каждой из ретровирусных последовательностей нуклеиновых кислот.
13. Ретровирусная продуцирующая клетка по любому из пп. 1-12, которая дополнительно содержит селектируемый маркер.
14. Ретровирусная продуцирующая клетка по любому из пп. 1-13, которая дополнительно содержит один или более трансгенов.
15. Ретровирусная продуцирующая клетка по любому из пп. 1-14, где клетка является клеткой млекопитающего.
16. Вектор на основе нуклеиновых кислот, содержащий не присущий млекопитающим участок начала репликации и способность удерживать, поменьшей мере, 25 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) ДНК, характеризующийся тем, что указанный вектор на основе нуклеиновых кислот содержит ретровирусные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие
gag и pol белки, и
env белок или его функциональный заменитель,
где каждая из ретровирусных последовательностей нуклеиновых кислот расположена в виде индивидуальных экспрессирующих конструкций внутри вектора на основе нуклеиновых кислот.
17. Вектор на основе нуклеиновых кислот по п. 16, который дополнительно содержит последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют РНК геном ретровирусной векторной частицы.
18. Вектор на основе нуклеиновых кислот по п. 16 или 17, который дополнительно содержит вспомогательный ген rev или аналогичный ему ген или функционально аналогичую систему.
19. Вектор на основе нуклеиновых кислот по любому из пп. 16-18, где вектор выбирают из: бактериальной искусственной хромосомы, искусственной дрожжевой хромосомы, P1-полученной искусственной хромосомы, фосмиды или космиды.
20. Вектор на основе нуклеиновых кислот по п. 19, где вектором является бактериальная искусственная хромосома.
21. Способ получения стабильной ретровирусной пакующей клеточной линии, содержащий
введение вектора на основе нуклеиновых кислот по любому из пп. 16-20 в культуру клеток млекопитающего; и
отбор внутри культуры клеток млекопитающего, которые имеют последовательности нуклеиновых кислот, кодируемые на векторе, интегрированном внутрь эндогенной хромосомы клетки млекопитающего.
22. Способ по п. 21, где клеткой млекопитающего является HEK 293 клетка.
23. Ретровирусная пакующая клетка, полученная посредством способа по п. 21 или 22.
24. Способ получения репликативно-дефектной ретровирусной векторной частицы, содержащий
введение вектора на основе нуклеиновых кислот по любому из пп. 16-20 в культуру клеток млекопитающего;
отбор внутри культуры клеток млекопитающего, которые имеют последовательности нуклеиновых кислот, кодируемые на векторе, интегрированном внутрь эндогенной хромосомы клетки млекопитающего; и
дополнительное культивирование клетки млекопитающего в условиях, при которых получают репликативно-дефектную ретровирусную векторную частицу.
25. Способ по п. 24, дополнительно содержащий выделение репликативно-дефектной ретровирусной векторной частицы.
26. Репликативно-дефектная ретровирусная векторная частица, полученная посредством способа по п. 24 или 25.
