Эффективная немейотическая интрогрессия аллелей - RU2016110827A
Код документа: RU2016110827A
Формула
1. Способ направляемой гомологией репарации для интрогрессии экзогенного аллеля в хромосомную ДНК клетки, включающий введение нацеленной системы эндонуклеаз и матрицы для направляемой гомологией репарации (НГР-матрицы), которая содержит экзогенный аллель, в клетку, с нацеленной системой нуклеаз, содержащей ДНК-связывающий член для специфического связывания эндогенной родственной последовательности в хромосомной ДНК, где нацеленная система нуклеаз и НГР-матрица действуют с целью внесения изменений в хромосомную ДНК для ее идентичности последовательности НГР-матрицы, чтобы провести интрогрессию экзогенного аллеля в хромосомную ДНК вместо эндогенного аллеля, с нацеленной системой эндонуклеаз и/или НГР-матрицей, содержащей признак, снижающий специфическое связывание нацеленной системы эндонуклеаз с ДНК.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что признак, снижающий специфическое связывание, включает несовпадение в последовательности ДНК-связывающего члена относительно эндогенной родственной последовательности и/или несовпадение в последовательности ДНК-связывающего члена относительно последовательности НГР-матрицы.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что нацеленная система эндонуклеаз содержит множество последовательностей TAL-эффекторных повторов, которые слиты с нуклеазой (TALEN-нуклеаза), с TALEN-нуклеазой, содержащей последовательность вариабельных диостатков в повторе (ВДП), и несовпадения в последовательности ВДП относительно эндогенной родственной последовательности.
4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что нацеленная система нуклеаз содержит Cas9-нуклеазу и руководящую РНК, с несовпадением, существующим в последовательности руководящей РНК относительно эндогенной родственной последовательности.
5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что нацеленная система эндонуклеаз содержит множество последовательностей TAL-эффекторных повторов, которые слиты с нуклеазой (TALEN-нуклеаза), с TALEN-нуклеазой, содержащей последовательность вариабельных диостатков в повторе (ВДП), и несовпадения в последовательности ВДП относительно последовательности НГР-матрицы.
6. Способ по п. 2, отличающийся тем, что нацеленная система нуклеаз содержит Cas9-нуклеазу и руководящую РНК, с несовпадением, существующим в последовательности руководящей РНК, относительно последовательности НГР-матрицы.
7. Способ по п. 2, отличающийся тем, что экзогенный аллель является природным аллелем и НГР-матрица содержит несовпадение, с несовпадением, создающим последовательность, которая не встречается в природе.
8. Способ по п. 2, отличающийся тем, что экзогенный аллель не содержит несовпадений и содержит ДНК, экспрессируемую клеткой.
9. Способ по п. 2, отличающийся тем, что экзогенный аллель содержит несовпадение и содержит ДНК, экспрессируемую клеткой.
10. Способ по п. 2, включающий выбор последовательности ДНК-связывающего члена и эндогенной родственной последовательности, так что внесение изменений в хромосомную ДНК для ее идентичности последовательности НГР-матрицы создает несовпадение в последовательности ДНК-связывающего члена относительно измененной последовательности хромосомной ДНК.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что экзогенный аллель является природным аллелем и НГР-матрица состоит из природного аллеля и ДНК, которая идентична последовательности хромосомной ДНК.
12. Способ по п. 10, отличающийся тем, что выбор последовательности ДНК-связывающего члена и эндогенной родственной последовательности дополнительно включает размещение второго несовпадения в эндогенной родственной последовательности, которое не изменяется, когда вносят изменения в хромосомную ДНК для ее идентичности НГР-матрице.
13. Способ по п. 2, включающий выбор последовательности ДНК-связывающего члена и эндогенной родственной последовательности, чтобы разместить несовпадение в эндогенной родственной последовательности относительно ДНК-связывающей последовательности, и внесение изменений в хромосомную ДНК для ее идентичности последовательности НГР-матрицы не убирало данное несовпадение.
14. Способ по п. 2, отличающийся тем, что несовпадение включает вставку, делецию или замену.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что вставка, делеция или замена имеет длину от 1 до 20 остатков.
16. Способ по п. 14, отличающийся тем, что вставка, делеция или замена имеет длину от 1 до 20 остатков.
17. Способ по п. 2, отличающийся тем, что несовпадение является одним однонуклеотидным полиморфизмом.
18. Способ по п. 2 включающий множество несовпадений.
19. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нацеленная система эндонуклеаз содержит пару TALEN-нуклеаз, которые локализуют хромосомную ДНК посредством спейсерной последовательности между парой нуклеаз, отличающийся тем, что признак включает выбор НГР-матрицы для получения изменения в длине спейсерной последовательности, чтобы блокировать расщепление ДНК парой TALEN-нуклеаз.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что длина спейсера уменьшается путем делеции или увеличивается путем вставки.
21. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что клетка выбрана из группы, состоящей из первичной клетки, первичной соматической клетки, зиготы, половой клетки, стволовой клетки, ооцита, сперматозоида и эмбриона.
22. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что систему нуклеаз вводят в клетку в виде мРНК.
23. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что клетка является клеткой домашнего скота.
24. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что клетка является клеткой позвоночного, отличного от человека, примата, свиньи, крупного рогатого скота, лошади, овцы, козы, курицы, кролика, рыбы, собаки, мыши, кошки, крысы или лабораторного животного.
25. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что клетка является гомозиготной по экзогенному аллелю.
26. Клетка, полученная способом по любому из пп. 1-25.
27. Набор, содержащий нацеленную систему нуклеаз и НГР-матрицу по любому из пп. 1-26.
28. Генетически модифицированное животное, полученное методами генной инженерии с изменениями в месте однонуклеотидного полиморфизма, животное, относящееся к породе, имеющей эндогенный аллель в хромосомной ДНК животного, животное, содержащее
экзогенный аллель, обнаруживаемый у другого вида или другой породы животного, с экзогенным аллелем, содержащим изменение в месте однонуклеотидного полиморфизма относительно эндогенного аллеля.
29. Животное по п. 28, содержащее множество однонуклеотидных полиморфизмов относительно эндогенного аллеля.
30. Способ получения «посадочной площадки» в хромосомной ДНК клетки, включающий введение нацеленной системы нуклеаз и НГР-матрицы в клетку, с нацеленной системой нуклеаз, содержащей ДНК-связывающий член для специфического связывания эндогенной родственной последовательности в хромосомной ДНК, где нацеленная система нуклеаз и НГР-матрица действуют с целью внесения изменений в хромосомную ДНК для ее идентичности последовательности НГР-матрицы, где последовательность НГР-матрицы содержит «посадочную площадку».
