Способ временной трансфекции для продуцирования ретровируса - RU2018118964A
Код документа: RU2018118964A
Формула
1. Нуклеиновокислотный вектор, содержащий ориджин репликации животных, не являющихся млекопитающими, и способный сохранять по меньшей мере 25 тысяч пар оснований (т.п.о.) ДНК, где указанный нуклеиновокислотный вектор отличается тем, что он содержит последовательности нуклеиновой кислоты ретровируса, кодирующие:
белки gag и pol, и
белок env, где каждая последовательность нуклеиновой кислоты ретровируса расположена в нуклеиновокислотном векторе в виде отдельных экспрессионных конструкций.
2. Нуклеиновокислотный вектор по п.1, который дополнительно включает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие РНК-геном частицы ретровирусного вектора.
3. Нуклеиновокислотный вектор по п.1, который дополнительно включает вспомогательный ген rev или его аналог.
4. Нуклеиновокислотный вектор по п.1, где вектор выбран из: бактериальной искусственной хромосомы; дрожжевой искусственной хромосомы; искусственной хромосомы, происходящей от P1; фосмиды; или космиды.
5. Нуклеиновокислотный вектор по п.4, где вектор представляет собой бактериальную искусственную хромосому.
6. Нуклеиновокислотный вектор по п.1, где последовательности нуклеиновой кислоты ретровируса происходят от ретровируса, выбранного из лентивируса, альфа-ретровируса, гамма-ретровируса или пенистого ретровируса.
7. Нуклеиновокислотный вектор по п.6, где последовательности нуклеиновой кислоты ретровируса происходят от лентивируса, выбранного из группы, состоящей из ВИЧ-1, ВИЧ-2, SIV, FIV, EIAV и висны.
8. Нуклеиновокислотный вектор по п.7, где последовательности нуклеиновой кислоты ретровируса происходят от ВИЧ-1.
9. Нуклеиновокислотный вектор по п.1, где белок env происходит от вируса везикулярного стоматита.
10. Нуклеиновокислотный вектор по п.1, который дополнительно включает элемент регуляции транскрипции.
11. Нуклеиновокислотный вектор по п.10, где элементом регуляции транскрипции является промотор CMV.
12. Нуклеиновокислотный вектор по п.1, который дополнительно включает изолятор.
13. Нуклеиновокислотный вектор по п.12, где изолятор находится между каждой из последовательностей нуклеиновой кислоты ретровируса.
14. Нуклеиновокислотный вектор по п.1, который дополнительно включает один или более трансгенов.
15. Нуклеиновокислотный вектор по п.1, который дополнительно включает внутренний сайт связывания с рибосомой (IRES).
16. Нуклеиновокислотный вектор по п.1, который дополнительно включает polyA-сигнал.
17. Нуклеиновокислотный вектор по п.1, который дополнительно включает интронную последовательность.
18. Нуклеиновокислотный вектор по п.1, который дополнительно включает сайт множественного клонирования (MCS).
19. Нуклеиновокислотный вектор по любому из пп. 1-18 для применения в способе продуцирования частиц ретровирусного вектора.
20. Способ продуцирования дефектной по репликации частицы ретровирусного вектора, включающий:
(a) введение нуклеиновокислотного вектора по любому из пп. 1-18 в культуру клеток-хозяев млекопитающих; и
(b) культивирование клеток-хозяев млекопитающих в условиях, способствующих продуцированию дефектной по репликации частицы ретровирусного вектора.
21. Способ по п.20, где клеткой-хозяином млекопитающих является клетка HEK 293.
22. Способ по п.20, где стадию введения (a) осуществляют методом липофекции, электропорации или химической трансфекции, такой как обработка фосфатом кальция.
23. Способ по п.20, где стадию культивирования (b) осуществляют путем инкубирования клеток-хозяев млекопитающих в условиях повышенной влажности.
24. Способ по п.20, который дополнительно включает выделение дефектной по репликации частицы ретровирусного вектора.
25. Способ по п.24, где выделение осуществляют с использованием фильтра, такого как мембрана, связывающаяся с низкомолекулярным белком.
26. Способ по п.24 или 25, где дефектные по репликации частицы ретровирусного вектора выделяют не более, чем через 72 часа после стадии введения (a).
27. Способ по п.26, где дефектные по репликации ретровирусные частицы выделяют в течение периода времени от 48 до 72 часов после стадии введения (a).
28. Дефектная по репликации частица ретровирусного вектора, полученная способом по любому из пп. 20-27.
