Способ периодического культивирования с подпиткой для получения бактериальных теней - RU2016137558A
Код документа: RU2016137558A
Формула
1. Способ получения препарата бактериальных теней, включающий этапы:
(a) обеспечения бактериальных клеток, содержащих литический ген, кодирующий белок, способный к образованию туннельной структуры в оболочке бактериальной клетки, где экспрессия литического гена находится под оперативным контролем регулируемого промотора;
(b) культивирования бактериальных клеток в условиях, в которых литический ген не экспрессируется, до конечной концентрации биомассы примерно 10-80 г сухого веса клеток (СВК)/л;
(c) после этапа (b), воздействия на бактериальные клетки условий, в которых литический ген экспрессируется, путем индукции регулируемого промотора, но лизис бактериальных клеток подавлен, и где бактериальные клетки подвергают воздействию по меньшей мере по существу стационарного состояния;
(d) после этапа (с), воздействия на бактериальные клетки условий, в которых осуществляется лизис бактериальных клеток, и впоследствии проведения дополнительного этапа индукции промотора; и
(e) получения итоговых бактериальных теней.
2. Способ по п. 1, где бактериальные клетки являются грамотрицательными бактериальными клетками, в частности, клетками Е. coli.
3. Способ по любому из пп. 1 и 2, где литический ген, кодирующий литический белок, является литическим геном Е бактериофага ФХ174.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где регулируемый промотор является химически или термически регулируемым промотором.
5. Способ по п. 4, где химически регулируемый промотор является lac или trp промотором.
6. Способ по п. 4, где термически регулируемый промотор является λcI857 промотором.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где культивирование бактериальных клеток проводят при периодическом культивировании с подпиткой.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где культивирование бактериальных клеток проводят до конечной концентрации биомассы примерно 20-70 г СВК/л, более предпочтительно примерно 30-60 г СВК/л, наиболее предпочтительно примерно 40-50 г СВК/л культуральной среды.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где этап (b) включает культивирование бактериальных клеток при удельной скорости потребления субстрата qS по меньшей мере примерно 0,4 г/гч (количество субстрата, потребляемое в единицу времени, в г/гч).
10. Способ по любому из пп. 1-9, где на этапе (с) удельная скорость потребления субстрата qS составляет примерно 0,1-0,3 г/гч.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где этап (с) включает индукцию регулируемого промотора путем добавления индуцирующего химического соединения и/или путем подведения температуры до температуры, обеспечивающей экспрессию.
12. Способ по любому из пп. 1-11, где на этапе (d) лизис бактериальных клеток индуцируют путем обеспечения импульса роста, в частности, путем обеспечения нутриентов для культуральной среды, более конкретно, путем обеспечения нутриентов для культуральной среды для получения скорости потребления субстрата qS по меньшей мере примерно 0,4 г/гч.
13. Способ по любому из пп. 1-12, где на этапе (d) после воздействия на бактериальные клетки литических условий, дополнительный этап индукции промотора является этапом химической или термической индукции промотора.
14. Способ по любому из пп. 1-13, где остаточные не лизированные бактериальные клетки инактивируют.
15. Способ по п. 14, где инактивация остаточных не лизированных бактериальных клеток включает инактивацию химическим инактиватором, способным к разрушению остаточных не лизированных бактериальных клеток, в частности, бета-пропиолактоном.
16. Способ по п. 14, где инактивация остаточных не лизированных бактериальных клеток включает совместную экспрессию нуклеазы, в частности, S-нуклеазы.
17. Способ по любому из пп. 1-16, где достигается эффективность Е-лизиса по меньшей мере примерно 70%, предпочтительно по меньшей мере примерно 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 96%.
18. Способ по любому из пп. 1-17, где условия культуральной среды контролируют по меньшей мере во время этапа (с) и этапа (d), в частности, посредством анализа радиочастотного импеданса.
19. Способ рекомбинантного получения интересующего белка, включающий этапы:
(a) обеспечения бактериальных клеток, содержащих (i) литический ген, кодирующий белок, способный к образованию туннельной структуры в оболочке бактериальной клетки, где экспрессия литического гена находится под оперативным контролем регулируемого промотора, и (ii) ген, кодирующий интересующий белок;
(b) культивирования бактериальных клеток в условиях, в которых литический ген не экспрессируется, до конечной концентрации биомассы примерно 10-80 г сухого веса клеток (СВК)/л;
(c) после этапа (b), воздействия на бактериальные клетки условий, в которых литический ген экспрессируется, путем индукции регулируемого промотора, но лизис бактериальных клеток подавлен, и где бактериальные клетки подвергают воздействию по меньшей мере по существу стационарного состояния;
(d) после этапа (с), воздействия на бактериальные клетки условий, в которых осуществляется лизис бактериальных клеток, а впоследствии проведения дополнительного этапа индукции промотора; и
(e) выделения и факультативно очистки интересующего белка, который экспрессируется во время этапа (b) и/или этапа (с).
20. Способ рекомбинантного получения белка Е бактериофага ФХ174 или его производных, включающий этапы:
(a) обеспечения бактериальных клеток, содержащих литический ген, кодирующий литический белок Е или его производные, где экспрессия литического гена находится под оперативным контролем регулируемого промотора;
(b) культивирования бактериальных клеток в условиях, в которых литический ген не экспрессируется, до конечной концентрации биомассы примерно 10-80 г сухого веса клеток (СВК)/л;
(c) после этапа (b), воздействия на бактериальные клетки условий, в которых литический ген экспрессируется, путем индукции регулируемого промотора, но лизис бактериальных клеток подавлен;
(d) после этапа (с), воздействия на бактериальные клетки условий, в которых осуществляется лизис бактериальных клеток, и впоследствии проведения дополнительного этапа индукции промотора; и
(e) выделения и факультативно очистки белка Е или его производных.
