Способы и средства повышения продуктивности рнк - RU2017100044A
Код документа: RU2017100044A
Формула
1. Способ синтеза молекулы РНК заданной последовательности, включающий следующие стадии:
а) определения доли (1) каждого из четырех нуклеотидов Г, А, Ц и У в указанной молекуле РНК, и
б) синтеза молекулы РНК путем транскрипции in vitro в оптимизированной для последовательности реакционной смеси, причем оптимизированная для последовательности реакционная смесь включает четыре рибонуклеозидтрифосфата (НТФ) ГТФ, АТФ, ЦТФ и УТФ, где доля (2) каждого из четырех рибонуклеозидтрифосфатов в оптимизированной для последовательности реакционной смеси соответствует доле (1) соответствующего нуклеотида в молекуле РНК, буфер, матрицу ДНК и РНК-полимеразу.
2. Способ по п. 1, в котором стадия б) включает подстадии:
б1) получения оптимизированной для последовательности смеси рибонуклеозидтрифосфатов (НТФ), включающей четыре рибонуклеозидтрифосфата (НТФ) ГТФ, АТФ, ЦТФ и УТФ, где доля (2) каждого из четырех рибонуклеозидтрифосфатов в оптимизированной для последовательности смеси рибонуклеозидтрифосфатов (НТФ) соответствует доле (1) соответствующего нуклеотида в указанной молекуле РНК, и
б2) синтеза молекулы РНК с помощью транскрипции in vitro в оптимизированной для последовательности реакционной смеси, включающей смесь НТФ подстадии (б1), буфер, матрицу ДНК и РНК-полимеразу.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором до начала транскрипции in vitro добавляют к оптимизированной для последовательности реакционной смеси стартовый нуклеотид, который соответствует первому нуклеотиду молекулы РНК.
4. Способ по п. 3, в котором стартовым нуклеотидом является нуклеозидмонофосфат, нуклеозиддифосфат, нуклеозидтрифосфат или динуклеозидтрифосфат.
5. Способ по п. 3, в котором стартовым нуклеотидом является аналог кэпа.
6. Способ по п. 3, в котором стартовый нуклеотид, который обнаруживают в первом положении указанной молекулы РНК, вносят в избытке по сравнению с долей этого нуклеотида в указанной молекуле РНК.
7. Способ по п. 1 или 2, в котором для нуклеотидов, не соответствующих первому нуклеотиду молекулы РНК, доля (1) и доля (2) отличаются не более чем на 10%.
8. Способ по п. 1 или 2, в котором по меньшей мере один рибонуклеозидтрифосфат частично или полностью замещен модифицированным нуклеозидтрифосфатом.
9. Способ по п. 8, в котором модифицированный нуклеозидтрифосфат выбирают из группы, включающей псевдоуридин-5'-трифосфат, 1-метилпсевдоуридин-5'-трифосфат, 2-тиоуридин-5'-трифосфат, 4-тиоуридин-5'-трифосфат и 5-метилцитидин-5'-трифосфат.
10. Способ по п. 1 или 2, в котором в процессе транскрипции in vitro оптимизированную для последовательности реакционную смесь дополняют оптимизированной для последовательности смесью рибонуклеозидтрифосфатов (НТФ) согласно описанному в п. 2.б1).
11. Способ по п. 1 или 2, в котором молекулу РНК выбирают из группы, включающей некодирующие и кодирующие молекулы РНК.
12. Способ по п. 1 или 2, в котором молекулой РНК является мРНК.
13. Способ по п. 1 или 2, в котором молекула РНК длиннее 100 нуклеотидов.
14. Способ по п. 1 или 2, в котором синтез молекулы РНК заданной последовательности осуществляют в качестве крупномасштабного синтеза.
15. Способ по п. 1 или 2, в котором противоионом НТФ является трис(оксиметил)-аминометан(трис).
16. Способ по п. 1 или 2, в котором синтез молекулы РНК путем транскрипции in vitro сопровождается отделением и определением количества не включенных НТФ.
17. Способ по п. 1 или 2, в котором синтез молекулы РНК путем транскрипции in vitro проводят в биореакторе (1).
18. Способ по п. 17, в котором биореактор (1) включает матрицу ДНК, иммобилизованную на твердой подложке.
19. Способ по п. 17, в котором биореактор (1) включает фильтрующую мембрану (21) для отделения нуклеотидов от оптимизированной для последовательности реакционной смеси.
20. Способ по п. 19, в котором фильтрующая мембрана (21) выбрана из группы, включающей регенерированную целлюлозу, модифицированную целлюлозу, полисульфон (ПСУ), полиакрилонитрил (ПАН), полиметилметакрилат (ПММА), поливиниловый спирт (ПВС) и полиарилэфирсульфон (ПАЭС).
21. Способ по одному из пп. 19 и 20, в которых фильтрующая мембрана (21) обладает величиной номинального отсечения по молекулярной массе примерно 10-50 кДа.
22. Способ по п. 17, в котором биореактор (1) включает сенсорный блок (41) для измерения в реальном времени концентрации нуклеотидов по ходу реакции.
23. Способ по п. 22, в котором сенсорный блок (41) измеряет концентрацию нуклеотидов с помощью фотометрического анализа.
24. Способ по одному из пп. 17-23, в которых биореактор (1) включает контрольный модуль (4), контролирующий добавление оптимизированной для последовательности смеси рибонуклеозидтрифосфатов (НТФ) согласно описанному в п. 2.б1).
25. Способ по п. 17, в котором биореактор (1) включает привод (43), который добавляет оптимизированную для последовательности смесь рибонуклеозидтрифосфатов (НТФ) согласно описанному в п. 2.б1).
26. Способ по п. 17, в котором биореактор (1) включает смолу для захвата молекул РНК и для отделения молекул РНК от других компонентов транскрипционной реакционной смеси.
27. Способ по п. 17, в котором биореактор (1) работает в полунепрерывном или непрерывном режиме.
28. Способ по п. 17, в котором биореактор (1) включает по меньшей мере один ионоизбирательный электрод.
29. Способ по п. 28, в котором по меньшей мере один ионоизбирательный электрод применяют для измерения концентрации одного или нескольких типов ионов в жидкости, который включен по меньшей мере в один отсек биореактора (1).
30. Способ по п. 29, в котором ион выбран из группы, включающей H+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl- и PO43-.
31. Молекула РНК, получаемая способом по одному из пп. 1-30.
32. Применение оптимизированной для последовательности смеси рибонуклеозидтрифосфатов (НТФ), оптимизированной для молекулы РНК заданной последовательности для синтеза молекулы РНК.
33. Применение по п. 32, в котором оптимизированную для последовательности смесь НТФ оптимизируют способом, включающим стадии:
а) определения доли (1) каждого из четырех нуклеотидов Г, А, Ц и У в молекуле РНК, и
б) получения оптимизированной для последовательности смеси рибонуклеозидтрифосфатов (НТФ), включающей четыре рибонуклеозидтрифосфата (НТФ) ГТФ, АТФ, ЦТФ и УТФ, где доля (2) каждого из четырех рибонуклеозидтрифосфатов в оптимизированной для последовательности смеси рибонуклеозидтрифосфатов (НТФ) соответствует доле (1) соответствующего нуклеотида в указанной молекуле РНК.
34. Применение по одному из пп. 32 и 33, в которых по меньшей мере один рибонуклеозидтрифосфат частично или полностью замещен модифицированным нуклеозидтрифосфатом.
35. Применение по п. 34, в котором модифицированный нуклеозидтрифосфат выбирают из группы, включающей псевдоуридин-5'-трифосфат, 1-метилпсевдоуридин-5'-трифосфат, 2-тиоуридин-5'-трифосфат, 4-тиоуридин-5'-трифосфат и 5-метилцитидин-5'-трифосфат.
36. Оптимизированная для последовательности смесь рибонуклеозидтрифосфатов (НТФ) для синтеза молекулы РНК заданной последовательности, включающая четыре рибонуклеозидтрифосфата (НТФ) ГТФ, АТФ, ЦТФ и УТФ, где доля (2) каждого из четырех рибонуклеозидтрифосфатов в оптимизированной для последовательности смеси
рибонуклеозидтрифосфатов (НТФ) соответствует доле (1) соответствующего нуклеотида в указанной молекуле РНК.
37. Набор, включающий оптимизированную для последовательности смесь рибонуклеозидтрифосфатов (НТФ), оптимизированную для молекулы РНК заданной последовательности согласно п. 32, или ее компоненты.
38. Биореактор (1) для синтеза молекул РНК заданной последовательности, включающий:
i) реакционный модуль (2) для проведения реакций транскрипции in vitro в оптимизированной для последовательности реакционной смеси согласно изложенному в п. 1.(б);
ii) модуль захвата (3) для временного захвата транскрибированных молекул РНК; и
iii) контрольный модуль (4) для контроля подачи компонентов оптимизированной для последовательности реакционной смеси в реакционный модуль (2), где
реакционный модуль (2) включает фильтрующую мембрану (21) для отделения нуклеотидов от оптимизированной для последовательности реакционной смеси, и
где контроль подпитки компонентами оптимизированной для последовательности реакционной смеси контрольным модулем (4) основан на измерении концентрации отделенных нуклеотидов.
39. Биореактор (1) по п. 38, в котором фильтрующая мембрана (21) является ультрафильтрующей мембраной (21) для отделения высокомолекулярных компонентов от низкомолекулярных компонентов, где предпочтительно фильтрующая мембрана (21) обладает величиной номинального отсечения по молекулярной массе в диапазоне 10-100 кДа, 10-75 кДа, 10-50 кДа, 10-25 кДа или 10-15 кДа, кроме того, предпочтительно фильтрующая мембрана обладает величиной номинального отсечения по молекулярной массе в диапазоне примерно 10-50 кДа.
40. Биореактор (1) по п. 38 или 39, в котором фильтрующую мембрану (21) выбирают из группы, включающей регенерированную целлюлозу, модифицированную целлюлозу, полисульфон (ПСУ), полиакрилонитрил (ПАН), полиметилметакрилат (ПММА), поливиниловый спирт (ПВС) и полиарилэфирсульфон (ПАЭС).
41. Биореактор (1) по п. 38 или 39, в котором реакционный модуль (2) включает матрицу ДНК, иммобилизованную на твердой подложке, в качестве основы для реакции транскрипции РНК.
42. Биореактор (1) по п. 38 или 39, в котором модуль захвата (3) включает смолу для захвата молекул транскрибированной РНК и для отделения транскрибированных молекул РНК от других растворимых компонентов смеси реакции транскрипции.
43. Биореактор (1) по п. 38 или 39, в котором модуль захвата (3) включает средства (31) для очистки и захвата транскрибированных молекул РНК.
44. Биореактор (1) по п. 38 или 39, в котором модуль захвата (3) включает средства (31) для элюирования захваченных транскрибированных молекул РНК, предпочтительно с помощью элюирующего буфера.
45. Биореактор (1) по п. 38 или 39, в котором биореактор (1) дополнительно включает модуль оттока (5) для возврата остаточной фильтрованной реакционной смеси в реакционный модуль (2) из модуля захвата (3) после захвата транскрибированных молекул РНК, причем предпочтительно средством (51) для возврата остаточной фильтрованной реакционной смеси является насос (51).
46. Биореактор (1) по п. 45, в котором модуль оттока (5) включает иммобилизованные ферменты или смолу для захвата разрушающих компонентов.
47. Биореактор (1) по п. 38 или 39, в котором контрольный модуль (4) включает сенсорный блок (41) для измерения в реальном времени концентрации отделенных нуклеотидов по ходу реакции.
48. Биореактор (1) по п. 47, в котором сенсорный блок (41) измеряет в качестве параметра реакции транскрипции концентрацию отделенных нуклеотидов с помощью фотометрического анализа.
49. Биореактор (1) по п. 48, в котором сенсорный блок (41) измеряет дополнительные параметры реакции транскрипции в фильтрованной реакционной смеси, причем предпочтительно дополнительными параметрами реакции транскрипции являются величина рН и/или соленость.
50. Биореактор (1) по п. 38 или 39, в котором контрольный модуль (4) контролирует добавление оптимизированной для последовательности смеси рибонуклеозидтрифосфатов (НТФ) по п. 32 к оптимизированной для последовательности реакционной смеси, причем предпочтительно биореактор (1) включает привод (43) для добавления оптимизированной для последовательности смеси рибонуклеозидтрифосфатов (НТФ) к оптимизированной для последовательности реакционной смеси.
51. Биореактор (1) по п. 38 или 39, в котором биореактор (1) действует в полунепрерывном или непрерывном режиме.
52. Биореактор (1) по п. 38 или 39, в котором биореактор (1) адаптирован для осуществления способа по одному из пп. 1-30.
